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1 猪重要经济性状候选基因研究进展1

1.1 繁殖性状候选基因研究进展1

1.1.1 雌激素受体基因1

1.1.2 卵泡刺激素基因2

1.1.3 促黄体素基因3

1.1.4 骨形态发生蛋白基因3

1.1.5 促性腺激素释放激素及其受体基因4

1.1.6 促红细胞生成素受体4

1.1.7 骨桥蛋白基因5

1.1.8 谷胱甘肽硫转移酶M2亚型基因6

1.1.9 TGF-β1基因6

1.1.10 催乳素受体基因7

1.1.11 视黄醇结合蛋白4基因7

1.1.12 视黄酸受体基因8

1.1.13 视黄素X受体基因8

1.1.14 甲状腺素运载蛋白基因9

1.2 脂肪性状候选基因研究进展9

1.2.1 肝细胞核因子-4α基因9

1.2.2 肝X受体基因10

1.2.3 Krox20基因11

1.2.4 脂蛋白脂肪酶基因11

1.2.5 脂肪酸结合蛋白基因12

1.2.6 肥胖基因12

1.2.7 激素敏感脂肪酶基因13

1.3 肉质性状候选基因研究进展13

1.3.1 腺苷一磷酸脱氨酶基因13

1.3.2 腺苷琥珀酸裂解酶基因14

1.3.3 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶／次黄嘌呤核苷酸环水解酶基因15

1.3.4 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶基因15

1.3.5 钙蛋白酶基因16

1.3.6 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因16

1.4 肌肉生长性状候选基因研究进展17

1.4.1 生肌调节因子家族17

1.4.2 肌细胞增强因子2家族19

1.4.3 肌肉生长抑制素基因19

1.4.4 Ⅰ型兰尼定受体基因20

1.5 抗逆性状候选基因研究进展20

1.5.1 抗黏液病毒基因20

1.5.2 天然抗性巨噬蛋白1基因21

1.5.3 唾液酸合成酶基因21

1.5.4 Toll样受体家族22

1.5.5 冷诱导RNA结合蛋白基因23

1.5.6 Y-box结合蛋白-1基因23

1.6 体长性状候选基因研究进展24

1.6.1 多形性腺瘤基因24

1.6.2 生殖细胞核因子24

1.6.3 配体依赖的核受体辅阻遏物25

2 猪基因克隆与序列分析26

2.1 材料与方法26

2.1.1 实验动物组织样26

2.1.2 菌株和克隆载体26

2.1.3 主要仪器设备26

2.1.4 主要药品和酶27

2.1.5 缓冲液及主要溶液的配制27

2.1.6 DNA的提取与检测28

2.1.7 组织总RNA的提取与检测29

2.1.8 引物设计与合成29

2.1.9 cDNA克隆35

2.1.10 基因组DNA克隆39

2.1.11 主要分子生物学软件及统计分析软件40

2.2 结果与分析40

2.2.1 HNF-4α基因克隆与序列分析40

2.2.2 LXRα基因克隆与序列分析46

2.2.3 RXRα基因克隆与序列分析51

2.2.4 MEF2A基因克隆及序列分析58

2.2.5 CstB基因克隆与序列分析65

2.2.6 RPS3基因克隆与序列分析68

2.2.7 OPN基因克隆与序列分析70

2.2.8 EPOR基因克隆与序列分析74

2.2.9 GnRH及其受体基因克隆与序列分析76

2.2.10 长白猪ADSL基因克隆与序列分析77

2.2.11 长白猪PurH基因克隆与序列分析81

2.2.12 民猪GPAT基因克隆与序列分析84

2.2.13 民猪MyoG基因克隆与序列分析87

2.2.14 SRPK1/3基因克隆与序列分析91

2.2.15 BMP-6基因克隆与序列分析98

2.2.16 IGFBP7基因克隆与序列分析106

2.2.17 CIRP基因克隆与序列分析112

2.2.18 PDZRN3基因克隆与序列分析114

2.2.19 COX1基因克隆与序列分析118

2.2.20 NANS基因克隆与序列分析121

2.2.21 NUMB基因克隆与序列分析124

2.2.22 IgG重链基因克隆与序列分析128

2.2.23 IRG6基因克隆与序列分析132

2.2.24 OAS1基因克隆与序列分析134

2.2.25 YB1基因克隆与序列分析137

2.3 讨论138

2.3.1 关于取样、RNA提取和反转录反应138

2.3.2 cDNA克隆139

2.3.3 基因组DNA部分片段克隆140

3 猪基因表达规律研究142

3.1 材料与方法142

3.1.1 实验动物组织样142

3.1.2 主要仪器设备142

3.1.3 总RNA的提取与检测142

3.1.4 引物设计与合成142

3.1.5 反转录反应143

3.1.6 线性增长试验143

3.1.7 PCR扩增143

3.1.8 琼脂糖凝胶电泳检测144

3.1.9 竞争性RT-PCR144

3.1.10 Real-time PCR反应145

3.1.11 数据分析145

3.2 结果与分析145

3.2.1 RBP4基因的时空转录情况145

3.2.2 RAR基因的时空转录情况149

3.2.3 RXR基因的时空转录情况153

3.2.4 TTR基因的时空转录情况157

3.2.5 HNF-4α基因的转录情况158

3.2.6 LXRα基因的时空转录情况159

3.2.7 OPN基因的时空转录情况161

3.2.8 MEF2基因的转录分析166

3.2.9 EGR2及其调控相关基因的转录情况检测171

3.2.10 MC3R基因的转录分析173

3.2.11 CstB基因的时空转录分析174

3.2.12 LPL基因的时空转录分析182

3.2.13 SRPK1/3基因的时空转录分析187

3.2.14 BMP-6基因的定量检测189

3.2.15 IGFBP7基因的定量检测189

3.3 讨论190

3.3.1 相对定量RT-PCR分析190

3.3.2 竞争性RT-PCR分析191

3.3.3 Real-time PCR分析191

4 猪基因单核苷酸多态性分析194

4.1 实验方法194

4.1.1 实验动物组织样194

4.1.2 药品和酶194

4.1.3 主要仪器设备194

4.1.4 基因组DNA的提取与检测194

4.1.5 引物设计与合成194

4.1.6 PCR-SSCP检测200

4.1.7 基因多态性的统计方法201

4.2 结果与分析202

4.2.1 EGR2基因的单核苷酸多态性分析202

4.2.2 HNF-4α基因的单核苷酸多态性分析203

4.2.3 ADSL基因的单核苷酸多态性分析206

4.2.4 PurH基因的单核苷酸多态性分析207

4.2.5 GPAT基因的单核苷酸多态性分析208

4.2.6 SRPK1/3基因的单核苷酸多态性分析210

4.2.7 GSTM2基因的单核苷酸多态性分析212

4.2.8 TGF-β1基因的单核苷酸多态性分析220

4.2.9 BMP-6基因的单核苷酸多态性分析223

4.2.10 GnRHR基因的单核苷酸多态性分析225

4.2.11 TLR4基因的多态性分析227

4.2.12 PLAG1基因多态性分析233

4.2.13 NR6A1基因多态性分析236

4.2.14 LCORL基因多态性分析240

4.3 讨论243

4.3.1 基因组DNA提取243

4.3.2 PCR-SSCP多态性分析244

5 猪基因功能分析246

5.1 实验方法246

5.1.1 缓冲液及主要试剂的配制246

5.1.2 引物的设计与合成247

5.1.3 细胞培养255

5.1.4 RNA干扰258

5.1.5 过量表达261

5.1.6 荧光素酶活性测定261

5.1.7 数据统计分析262

5.1.8 生物信息学分析262

5.2 结果与分析262

5.2.1 Krox20对脂肪细胞的影响262

5.2.2 Smad3、GDF8和MyoD对猪骨骼肌卫星细胞的影响及互作274

5.2.3 民猪MyoG基因启动子核心区定位284

5.2.4 民猪CYP1A1基因启动子核心区定位288

5.2.5 民猪MC4R基因启动子核心区定位295

5.2.6 民猪FST基因启动子核心区定位299

5.3 讨论303

5.3.1 shRNA的设计与筛选303

5.3.2 前体脂肪细胞体外培养303

5.3.3 骨骼肌卫星细胞培养及鉴定308

5.3.4 转染效率的影响因素309

5.3.5 Krox20对猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响309

5.3.6 Smad3、MyoD与GDF-8对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响311

5.3.7 Smad3、MyoD与GDF-8在骨骼肌卫星细胞增殖过程中的调控网络关系312

5.3.8 MyoG基因启动子区域生物信息学分析313

5.3.9 MyoG基因启动子活性分析314

5.3.10 CYP1A1基因启动子活性分析315

5.3.11 MC4R基因启动子活性分析315

6 猪基因组织特异性表达分析317

6.1 材料与方法317

6.1.1 载体与菌株317

6.1.2 MC4R特异表达载体的构建与表达317

6.1.3 FST基因特异表达载体的构建与表达319

6.2 结果与分析321

6.2.1 MC4R基因特异表达载体的构建与表达321

6.2.2 FST基因特异表达载体的构建与表达327

6.3 讨论335

6.3.1 MC4R-P1/P2重组质粒的构建335

6.3.2 FST-P1、FST-P2重组质粒的构建335

6.3.3 FST-P3、FST-P4重组质粒的构建336

6.3.4 Tet-On系统的优点336

6.3.5 瞬时转染后细胞状态的观察337

6.3.6 诱导表达基因的检测337

6.3.7 诱导MC4R基因对CMS系统的影响338

6.3.8 FST与MyoD、MyoG、MSTN、GDF11之间的互作分析338

7 高通量测序分析猪差异表达基因340

7.1 材料与方法340

7.1.1 实验材料与测序340

7.1.2 数据整理与分析340

7.2 结果与分析342

7.2.1 测序质量评估342

7.2.2 clean tag拷贝数分布统计342

7.2.3 clean tag比对统计342

7.2.4 差异表达基因及部分功能基因的表达342

7.2.5 反义转录本与新转录本预测结果343

7.2.6 GO功能显著性富集分析343

7.2.7 Pathway显著性富集分析345

7.2.8 测序饱和度分析345

7.3 讨论346

7.3.1 高通量测序数据的初步分析346

7.3.2 部分差显基因或转录子的表达分析346

7.3.3 GO和Pathway分析347

参考文献348

附录359

附录一 本研究中获得的GenBank登录号359

附录二 本研究涉及的学位论文361

附录三 差异倍数在2倍以上的上调差异基因363

附录四 差异倍数在2倍以上的下调差异基因368

附录五 彩色插图459

附录六 本研究涉及的猪种469

附录七 参编人员471