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绪论 徐钤 彭朝晖1

第一节 基因转移和基因治疗的早期历史1

一、前言1

二、遗传学和分子遗传学的诞生1

三、对基因治疗的思考2

四、哺乳动物细胞的体外遗传修饰3

五、动物的直接基因转移4

六、病毒载体的起源5

七、重组DNA技术的诞生5

八、基因治疗的早期尝试6

一、目前有关基因治疗的争论9

第二节 基因治疗的现状9

二、人工流产与基因治疗10

三、前景10

第三节 基因治疗的策略11

第一篇 遗传型基因治疗13

第一章 体细胞的分子遗传学基础 黄伟达 邱信芳 艾星滨13

第一节 人体基因组特征13

第二节 人体基因的转录与调控13

一、顺式调控元件14

二、反式作用因子15

第三节 mRNA的加工15

一、5′端加帽15

二、内含子的剪接反应16

三、3′端加polyA尾18

四、mRNA分子包装19

第四节 蛋白质翻译及后加工19

第五节 细胞周期20

一、细胞周期21

二、细胞增殖控制因素22

第六节 体细胞培养的生物学22

一、离体细胞培养的形态特点22

二、培养细胞的生长和增殖23

第七节 基因定位和人类基因图谱24

一、直接注射法26

第一节 基因转移的非病毒方法26

第二章 体细胞基因转移 贺新军26

二、磷酸钙共沉淀法27

三、脂质体转染法27

四、受体介导的基因转移28

五、显微注射法28

六、电穿孔法28

七、微离子轰击法29

第二节 基因转移的病毒方法29

一、逆转录病毒载体30

二、DNA病毒载体33

一、基因扩增39

第三章 目的基因的表达与调控 郑文超39

第一节 提高外源基因在细胞中的拷贝数39

二、穿梭质粒40

第二节 转录水平的提高41

一、人巨细胞病毒（hCMV）启动子41

二、猴病毒（SV40）启动子42

三、小鼠金属硫蛋白基因（mMT-1）启动子42

四、逆转录病毒长末端重复序列（LTR）43

五、其它启动子43

六、腺病毒EIA基因上游的多个增强子44

七、C/EBP结合顺序44

八、内含子顺序45

第四节 翻译和翻译后加工水平的调节46

第三节 转录后水平的调节46

第五节 载体内顺序间的相互影响47

第六节 高效表达的综合考虑47

第四章 基因治疗的靶细胞 徐钤49

第一节 骨髓细胞49

一、反转录病毒载体的应用49

二、制作活体动物模型的困难51

三、骨髓移植的展望52

第二节 其它体细胞54

一、成纤维细胞54

三、肝细胞56

二、角质细胞56

五、中枢神经系统细胞58

四、内皮细胞58

六、肌细胞60

七、上皮细胞61

八、滑膜细胞62

九、淋巴细胞63

第三节 生殖细胞63

一、转基因动物64

二、基因表达的组织特异性和发育调节64

三、人类疾病的转基因模型65

一、胸腺嘧啶核苷激酶基因69

第五章 基因治疗中的选择系统 卢珂 叶建江69

第一节 正选择系统69

二、新霉素磷酸转移酶基因70

三、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因71

四、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因71

五、二氢叶酸还原酶基因72

六、色氨酸合成酶基因72

七、组氨醇脱氢酶基因73

八、腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因73

十、天冬酰胺合成酶基因74

九、潮霉素抗性基因74

十一、乌本苷抗性基因75

十二、人多药物抗性基因75

十三、腺苷脱氨酶基因75

第二节 负选择系统75

一、胞嘧啶脱氨酶基因76

二、胸苷激酶基因76

三、白喉毒素A链基因76

第三节 选择基因对目的基因表达的影响77

第四节 共转染中的选择系统77

一、β-半乳糖苷酶基因78

第五节 不用选择培养基的选择系统78

二、氯霉素乙酰转移酶基因79

三、人凝血因子Ⅸ的cDNA79

第六节 基因治疗中个体水平的选择系统79

第七节 基因治疗中选择系统的合理应用80

第六章 生殖细胞基因操作和转基因动物 胡以平81

第一节 转基因小鼠的制备81

一、畸胎瘤细胞植入法81

二、逆转录病毒转染法82

三、显微注射法82

四、定点整合法83

第二节 外源基因在受体基因组的整合84

第三节 外源基因在转基因小鼠内的表达85

第四节 转基因小鼠在基因治疗研究中的应用86

一、基因表达的调节控制87

二、遗传病的转基因小鼠模型95

三、体内定点修复的实验系统98

第七章 遗传病的基因治疗100

第一节 概述 彭朝晖100

一、经典型遗传病100

二、复合型遗传病101

三、获得型遗传病101

四、遗传病的基因治疗临床方案101

五、可作为基因治疗对象的人类遗传病102

第二节 基因治疗的评定标准和候选对象 徐钤104

第三节 严重复合性免疫缺陷症的体细胞基因治疗 彭朝晖 徐钤105

一、SCID的临床特征105

二、SCID病人免疫反应的实验室特征105

三、SCID的遗传学106

四、SCID的传统治疗方法108

五、SCID基因治疗的靶细胞108

六、ADA（一）SCID的基因治疗108

第四节 血友病B的基因治疗 卢大儒 王健民 薛京伦111

一、血友病B的临床和遗传学111

二、血友病B基因治疗的实验和临床前研究112

三、血友病B基因治疗临床研究114

一、家族性高胆固醇血症的遗传和临床特征116

（一）遗传学116

第五节 家族性高胆固醇血症的Ex Vivo基因治疗 柯正 徐湘民116

（二）代谢117

（三）临床表现特征117

（四）替代疗法118

二、临床前研究118

（一）WHHL家兔的Ex Vivo基因治疗118

（二）人肝细胞的分离和转染119

（三）灵长类动物的Ex Vivo基因治疗120

（二）病人的评估与选择122

（三）载体与病毒122

（一）概述122

三、FH的基因治疗临床方案122

（四）肝细胞分离和转染124

（五）转染肝细胞的输入124

（六）转染肝细胞功能的检测125

（七）排斥反应的检测125

四、FH基因治疗的优缺点126

（一）基因治疗的有效性126

（二）肝切除与肝细胞输入的危险性127

（三）LDLR基因转移与表达的危险性127

（一）囊性纤维变性的遗传缺陷和病理学改变128

第六节 囊性纤维变性的基因治疗 张璐 彭朝晖128

一、囊性纤维变性概述128

（二）囊性纤维变性的临床特征129

（三）CF的综合性治疗129

二、囊性纤维变性的基因治疗基础研究130

（一）载体的构建130

（二）重组Ad·CB-CFTR的制备131

（三）CF损伤的体外修补研究131

三、囊性纤维变性基因治疗临床前研究132

（一）病毒的制备132

（三）人类非CF病变异种移植物的安全性及有效性研究134

（二）CF患者呼吸道移植物模型134

四、囊性纤维变性的基因治疗临床应用137

（一）病员选择137

（二）患者评估137

（三）临床方案138

（四）治疗评估139

（五）危险因素139

第二篇 表遗传型基因治疗143

第八章 反义核酸与基因治疗 黄胜和143

第一节 绪言143

一、“反义”的定义143

二、天然反义RNA对基因表达的调节145

第二节 反义核酸抑制作用的机制150

一、细胞核中的抑制作用150

二、细胞浆中的抑制作用152

第三节 反义核酸的设计和应用154

一、概述154

二、寡聚脱氧核苷酸及其衍生物157

三、反义RNA159

第九章 Ribozyme及其在基因治疗中的应用 周辰162

第一节 Ribozyme的发现及其意义162

一、一类内含子163

第二节 Ribozyme的生物学163

二、二类内含子165

三、RNase p165

四、锤头状Ribozyme结构166

五、发夹式Ribozyme结构168

六、丁型肝炎病毒（HDV）中的Ribozyme169

第三节 实用性Ribozyme的设计和研究170

一、Ribozyme从顺式到反式的转变171

二、提高Ribozyme的活性及对RNase的抗性173

三、将Ribozyme直接导入细胞的研究174

四、Ribozyme在细胞内的高效表达174

五、影响Ribozyme在细胞内活性的因素175

六、反式Ribozyme在细胞内活性的确定及对细胞功能的影响176

第四节 Ribozyme的应用177

一、在抗AIDS病中的应用177

二、在其它方面的应用178

第五节 存在的问题和应用前景179

第十章 恶性肿瘤的基因治疗182

第一节 概述 彭朝晖 郭亚军182

一、人基因标记182

二、恶性肿瘤基因治疗方案183

一、rb基因对肿瘤细胞表型逆传的研究187

第二节 肿瘤抑制基因在肿瘤基因治疗中作用 赵健 彭朝晖 徐钤187

二、p53基因在肿瘤基因治疗中的作用188

（一）p53基因和基因产物188

（二）p53基因突变189

（三）p53蛋白和病毒癌蛋白的相互作用189

（四）p53基因对细胞生长的调节作用190

（五）p53基因的肿瘤细胞表型逆转实验研究190

（六）用p53基因治疗非小细胞性肺癌的临床应用191

第三节 MDR在肿瘤基因治疗中的研究与应用 吴曙光193

一、MDR基因耐药性的特点193

（二）MDR的基因结构194

（三）MDR基因的转录194

二、MDR基因结构和表达调控194

（一）MDR基因家族194

（四）MDR基因的表达与调控195

三、多药耐药的机理196

（一）MDR与其基因产物P-糖蛋白的关系196

（二）谷胱甘肽解毒途径酶的变化196

（三）拓扑异构酶Ⅰ的变化197

（四）DNA损伤修复能力的改变197

四、多药耐药的逆转197

（一）MDR拮抗剂197

（四）与DNA修复有关的MDR逆转198

五、MDR基因在肿瘤基因治疗中的应用198

（二）与P-gp有关的MDR逆转198

（三）与GSH依赖性解毒酶系统有关的MDR逆转198

第四节 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/Ganciclovir系统用于恶性肿瘤基因治疗 伍志坚 吴小兵 彭朝晖201

一、HSV-tK/GCV系统用于恶性肿瘤基因治疗概况201

二、tK基因的功能201

三、tK基因“杀伤”肿瘤细胞的机理202

四、在脑肿瘤和脑转移瘤基因治疗中的应用203

（一）脑肿瘤和脑转移瘤背景简介203

（二）逆转录病毒介导的基因转移脑肿瘤细胞203

（三）临床前研究（1）：tk基因转导治疗肿瘤的实验研究204

1.HSV-tK产细胞对腹腔内脏的毒性评估205

（四）临床前研究（2）：毒性研究205

2.对脑组织的毒性研究206

3.灵长类动物的毒性研究206

（五）临床应用207

1、实验设计和方案法207

2、治疗步骤和治疗用品209

3、潜在的危险性210

第五节 细胞因子基因在肿瘤治疗中的应用 车小燕 郭亚军211

一、概述211

（二）将细胞因子基因导入淋巴细胞212

（三）将细胞因子基因导入成纤维细胞或骨髓造血干细胞212

（一）直接将细胞因子基因导入肿瘤细胞212

二、细胞因子基因治疗的基本方法212

三、细胞因子基因的选择应用213

四、细胞因子基因治疗抗肿瘤作用原理213

五、几种主要的细胞因子基因治疗的研究进展213

（一）IL-2基因疗法213

（二）IL-4基因疗法214

（三）IL-6基因疗法215

（四）IL-7基因治疗215

（五）INF基因治疗215

（六）TNF基因治疗216

（七）C-CSF和GM-CSF基因治疗216

第六节 MHC基因在肿瘤治疗中的作用 施乐华 郭亚军217

一、肿瘤免疫应答的限制因素217

二、MHC在肿瘤免疫中的作用218

三、MHC基因对肿瘤免疫基因治疗的实验研究219

第七节 IGF反义RNA对恶性肿瘤的基因治疗 王小宁 罗爱武 郭亚军221

一、基因来源及鉴定方法221

（一）天然IGF的来源221

（二）基因工程制备IGF-I反义RNA222

二、IGF-I反义RNA基因治疗恶性肿瘤的原理223

三、临床前研究：动物实验结果224

四、临床应用方案224

（一）病例选择224

（二）实施方案224

2、体内（in vivo）治疗225

1、体外（ex vivo）治疗225

第八节 共同刺激因子基因在肿瘤治疗中的作用 谢天培 施崇山 郭亚军227

一、T细胞的活化双信号系统227

二、B7基因导入进行肿瘤基因治疗的实验研究228

三、B7基因在肿瘤治疗中的临床应用229

第九节 多基因转染在肿瘤治疗中的作用 沈峰 郭亚军230

一、共转染230

二、细胞融合230

第十一章 AIDS的基因治疗 周辰233

第一节 HIV的生物学特性234

一、HIV的基本结构234

二、HIV的生命周期234

三、HIV的生物学特征235

一、抗病毒治疗——细胞内免疫236

第二节 抗AIDS的基因治疗236

二、免疫治疗及其它241

第三节 今后的研究重点及发展前景243

一、探讨抗HIV变异株的途径和方法243

二、建立动物模型244

三、研究更理想的导入技术244

四、发展多能干细胞基因治疗245

五、加强HIV生物学特性及相关领域的基础研究246

第十二章 心血管病的基因治疗 彭朝晖 郭亚军249

一、重组腺病毒载体（ADV-tk）的构建249

四、检测250

二、动物试验250

三、实验方法和结果250

第十三章 同源重组与基因治疗 王宏伟 卢大儒252

第一节 同源重组与基因定点整合252

第二节 定点修饰253

一、人工位点的定点修饰253

二、天然位点的定点修饰254

第三节 定点整合研究的手段255

一、以ES细胞作为实验材料255

二、选择系统的改进256

一、定点整合基因治疗的优点257

第四节 基因治疗的定点修复257

二、定点整合基因治疗的不足258

第三篇 基因治疗的问题与展望260

第十四章 基因治疗的安全性 王宏伟 谭骏260

第一节 潜在风险260

第二节 制备的反转录病毒的安全性260

第三节 病毒载体进入体内的安全性考虑262

一、病毒载体随机插入的安全性问题262

二、同源或非同源重组的安全性问题264

三、非相关顺序转移到靶细胞中264

第四节 临床前的安全性检测手段265

一、野生型反转录病毒的检测265

五、病毒污染265

六、种系感染的可能性265

四、载体突变265

二、细胞恶性转化的检测266

三、其它方面267

第十五章 基因治疗的伦理学与社会问题 王宏伟268

一、风险估算268

二、原则的制订268

三、基因治疗的社会反映269

四、生殖细胞基因治疗的伦理讨论269

五、人类遗传工程的内容及禁区270

第十六章 基因治疗的现状与展望 薛京伦272

一、引言278

附录一、人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点中华人民共和国卫生部药政司（1993.5.5）278

二、立题的依据和基础280

三、细胞群体的鉴定280

四、临床前试验281

五、不同批号制品的质控及临床前试验283

六、关于重组病毒的操作及设施284

七、临床试验的考虑要点284

八、结语284

三、Millennium公司285

四、Magenta公司285

一、Darwin Molecular公司285

二、Sequaha Therapeutics285

附录二 世界上基因治疗公司简介285

五、基因医学公司286

六、基因治疗公司286

七、Vical公司286

八、应用免疫科学公司（AIS）286

九、Somatix治疗公司286

十、Targe Tech公司287

十一、Viagene公司与Chiron公司287

十二、GeneTech公司287