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第一章　细胞培养概述及细胞培养前的准备工作1

第一节　细胞培养概述1

资料单1

一、细胞培养的发展史1

二、细胞培养的基本概念及优缺点3

三、细胞培养的作用4

四、细胞培养实验的基本要求7

五、与细胞培养相关的专业术语8

第二节 细胞培养实验室的设置及设备13

资料单13

一、细胞培养实验室的设置14

二、细胞培养实验室的设备16

技能单1 细胞培养实验室设备的使用、保养和作用18

一、超净工作台19

二、培养箱20

三、倒置显微镜22

四、冰箱23

五、干热灭菌箱23

六、高压蒸汽灭菌器24

七、离心机26

八、液氮罐27

技能单2　认识常用细胞培养的器材28

一、细胞培养瓶28

二、培养皿29

三、多孔培养板29

四、加样器及吸头30

五、其他与培养操作有关用品31

第三节　细胞培养用品的清洗和消毒灭菌32

资料单32

一、培养用品的清洗32

三、培养用品的消毒灭菌34

二、包装34

技能单1　清洗液的配制及培养器材的清洗、包装与消毒38

一、清洗液的配制38

二、玻璃器皿的清洗、包装、消毒39

三、橡胶制品的清洗、包装、消毒42

四、塑料制品的清洗42

五、器材包装时应注意事项和要求42

技能单2　正压式除菌滤器及一次性滤器的使用43

一、正压除菌滤器43

二、小型针头滤器的使用44

第二章　细胞培养用液和培养液46

第一节　细胞培养用液46

资料单46

一、水和缓冲溶液47

二、生理盐水和平衡盐溶液48

三、其他常用液49

技能单1 常用BSS液的配制52

一、Hank's液的配制52

二、D-Hank's液的配制53

三、配制BSS液的要求54

四、Hank's液的作用54

技能单2　常用细胞消化液的配制55

一、0.25％胰蛋白酶溶液的配制55

二、0.02％EDTA的配制56

三、0.02％EDTA+0.25％胰蛋白酶（1∶1）混合液的配制56

技能单3　常用抗生素溶液的配制57

一、青霉素、链霉素（双抗）液58

二、卡那霉素液58

三、制霉菌素液58

资料单59

一、培养细胞的生长条件59

第二节　细胞培养液59

二、培养液（基）64

技能单1　DMEM培养液的配制80

一、配方81

二、合成培养液的配制81

技能单2　PRMI-1640溶液的配制83

一、不完全RPMI-1640培养液配方83

二、合成培养液的配制83

第三章　细胞培养的基本技术85

第一节　培养细胞的取材与分离85

资料单85

一、培养室内的无菌操作85

二、培养细胞的取材87

三、组织材料的分离89

技能单1　组织的剪切与消化技术92

技能单2　细胞计数技术93

技能单3　细胞密度换算95

第二节　原代培养96

资料单96

一、组织块培养法97

二、消化培养法98

三、器官培养99

技能单1　鸡胚原代细胞的培养100

一、鸡胚的孵育100

二、鸡胚的发育过程100

三、操作步骤101

技能单2　小鼠胎儿细胞的原代培养103

一、组织块培养法104

二、消化培养法105

第三节　传代培养和细胞系的维持106

资料单106

二、细胞传代方法107

一、原代培养的首次传代107

三、细胞系的维持109

四、培养细胞的纯化109

技能单1　细胞传代技术111

技能单2　培养细胞的纯化114

一、酶消化法114

二、反复贴壁法114

第四节　培养细胞的特性及观察115

资料单115

一、培养细胞的生长方式及类型115

二、培养细胞的生长特点117

三、培养细胞的生长过程119

技能单1　培养细胞常规检查124

一、培养细胞常规检查的意义124

二、检查营养液pH值124

三、细胞污染的检查及排除125

四、健康细胞与衰老死亡细胞的观察129

技能单2　细胞活性检查130

一、原理130

二、配制染色液130

三、制备细胞悬液130

四、染色131

技能单3　培养细胞染色体的染色及观察132

技能单4　细胞生长曲线的绘制134

技能单5　细胞的克隆形成实验135

一、概述135

二、平板克隆形成实验136

三、软琼脂克隆形成实验136

四、平板琼脂克隆培养法137

五、提高克隆形成率的方法137

资料单139

第一节　病毒的结构及生物学特性139

第四章　病毒的细胞培养技术139

一、病毒的基本特征140

二、病毒的形态结构141

三、毒粒的化学组成143

四、病毒的复制145

五、病毒的培养148

六、病毒的生物学特性148

第二节　病毒的细胞培养151

资料单151

一、细胞培养用于病毒研究的优点151

二、用细胞培养分离病毒152

三、用细胞培养法制备病毒血清学抗原157

技能单1　病毒的细胞培养技术158

一、制备病毒悬液158

二、将病毒接种于培养细胞159

技能单2　观察细胞病变160

第三节　病毒的鉴定技术163

资料单163

一、病毒蚀斑技术163

二、病毒蚀斑抑制试验167

三、细胞培养系统中的中和试验168

技能单1　病毒的蚀斑技术173

一、配制双层营养琼脂糖173

二、操作步骤173

技能单2　单层细胞微量中和试验175

第五章　细胞冻存、复苏及运输177

第一节　细胞的冻存177

资料单177

一、细胞冻存的意义177

二、细胞的冻存原理178

一、培养瓶培养细胞的冻存179

技能单　细胞冻存技术179

二、骨髓瘤细胞的冻存181

第二节　细胞的复苏及运输182

资料单182

一、细胞的复苏183

二、培养细胞的运输185

技能单　细胞的常规复苏技术186

第六章　单克隆抗体（McAb）生产技术188

第一节　杂交瘤技术的概述188

资料单188

一、杂交瘤技术发展简史188

二、杂交瘤技术的概念与分类189

三、单克隆抗体的概念及特性189

四、单克隆抗体产生的原理191

一、抗原的纯度问题193

二、免疫动物的选择193

资料单193

第二节　动物免疫193

三、免疫194

技能单　动物免疫技术197

一、颗粒性抗原的免疫方法197

二、可溶性抗原的免疫方法197

第三节 骨髓瘤细胞的准备199

资料单199

一、骨髓瘤细胞系的种类199

二、骨髓瘤细胞系的选择200

三、骨髓瘤细胞的培养201

四、血清的筛选203

技能单　骨髓瘤细胞的复苏及培养观察204

二、饲养细胞的类型206

一、饲养细胞及其作用206

资料单206

第四节　饲养细胞及其制备206

技能单　饲养细胞制备技术207

第五节　细胞融合209

资料单209

一、细胞融合209

二、细胞融合剂的选择210

技能单1　细胞融合用主要试剂的配制211

一、不完全RPMI-1640培养液212

二、完全RPMI-1640培养液212

三、氨基喋呤（A）贮存液（100x,4×10mol/L）212

四、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液［100H:10～2mol/L;T:1.6×(10～3)mol/L］212

技能单2　制备免疫脾细胞悬液213

七、50％PEG213

六、HT培养液213

五、HAT培养液213

技能单3　制备骨髓瘤细胞悬液215

技能单4　细胞融合技术215

第六节　杂交瘤的培养及观察217

资料单217

杂交瘤细胞的选择性培养217

技能单　杂交瘤的培养观察220

第七节　单克隆抗体的筛选与检测221

资料单221

一、概述221

二、ELISA原理222

三、ELISA间接法223

技能单1　ELISA试剂的配制223

技能单2　ELISA间接法筛选杂交瘤阳性孔法225

资料单227

一、杂交瘤克隆化概述227

第八节 杂交瘤的克隆化及冻存与复苏227

二、杂交瘤克隆化方法228

三、杂交瘤细胞的冻存与复苏230

技能单1　克隆化技术1——有限稀释法231

技能单2　克隆化技术2——软琼脂法233

技能单3　克隆化技术3——单细胞显微操作法234

第九节 单克隆抗体的大量制备及影响因素和失败原因分析235

资料单235

一、单克隆抗体的制备235

二、单克隆抗体的鉴定236

三、McAb的影响因素和失败原因分析237

技能单1　腹水制备单克隆抗体法238

技能单2　ELISA间接法检测腹水中抗体滴度241

资料单243

一、卵泡的发育及其形态特点243

第一节　卵细胞243

第七章　卵细胞及胚胎干细胞培养技术243

二、卵子245

三、卵母细胞的采集和成熟培养247

四、受精卵（胚胎）的早期发育251

五、早期胚胎的体外培养253

技能单1　冲卵液的配制255

技能单2　屠宰家畜卵巢卵母细胞的采集256

技能单3　活体卵巢卵母细胞的采集257

技能单4　猪卵母细胞的体外成熟培养258

技能单5　小鼠的胚胎回收与检胚260

第二节　胚胎干细胞培养261

资料单261

一、早期胚胎来源的ES细胞分离克隆程序261

二、胚胎干细胞培养及要求262

三、影响胚胎干细胞分离克隆的因素263

技能单　胚胎干细胞的培养267

参考文献269