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第一章 绪论1

第一节 分子生物学技术的历史和意义1

一、医学分子生物学是分子生物学的重要分支1

二、基因操作是所有分子生物学技术的核心1

三、蛋白质研究较基因操作更为复杂2

第二节 医学分子生物学实验设计3

一、研究课题的选择3

二、研究策略和技术路线设计4

三、实验方法选择原则4

四、实验设计注意事项5

五、实验数据的整理和分析5

第三节 分子生物学实验实施6

一、实验室基本设备需求6

二、实施实验的细节6

三、实验室安全7

第二章 聚合酶链反应8

第一节 PCR技术概述8

一、PCR技术的发展历程及科学价值8

二、PCR技术的基本原理9

三、PCR反应体系9

四、PCR反应的基本步骤10

第二节 PCR的引物设计和反应条件优化11

一、PCR引物的设计11

二、PCR反应条件的优化11

第三节 PCR技术的基本类型及应用12

一、PCR技术的主要类型12

二、PCR技术的实际应用15

第四节 PCR产物的定性和定量检测方法17

第五节 实时定量PCR18

一、实时定量PCR技术的原理18

二、应用于实时定量PCR中的荧光探针与荧光染料20

三、实时定量PCR的实验流程21

四、实时定量PCR常见问题及优化方案22

五、实时荧光定量PCR的国际化标准23

六、实时定量PCR技术在医学上的应用25

第三章 DNA体外重组27

第一节 基本流程和必备工具27

一、基本流程28

二、常用工具酶28

三、基因载体31

第二节 DNA重组前的准备工作34

一、选择载体34

二、载体的准备35

三、目的DNA的结构设计36

第三节 目的DNA片段的获取及准备36

一、获取DNA片段的方法选择36

二、DNA片段的末端处理38

第四节 DNA片段与载体的重组38

一、DNA片段与载体的连接方式38

二、连接反应时需要考虑的一些因素40

三、非酶切DNA体外重组41

第五节 重组DNA的克隆化及鉴定41

一、重组DNA转化大肠埃希菌41

二、重组DNA的克隆筛选及鉴定43

第四章 DNA序列分析技术46

第一节 DNA测序技术的发展46

一、第一代测序技术46

二、第二代测序技术47

三、第三代测序技术47

第二节 常规DNA序列测定的原理47

一、双脱氧测序法的原理47

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序的原理48

第三节 自动激光荧光DNA测序——第一代测序技术48

一、自动激光荧光DNA测序的基本原理48

二、自动激光荧光DNA测序的基本程序49

三、自动激光荧光DNA测序的注意事项50

第四节 其他DNA序列分析新技术51

一、焦磷酸测序51

二、循环芯片测序——第二代测序技术52

三、单分子测序——第三代测序技术55

第五节 对所获 DNA序列的初步分析57

一、同源序列比对和限制性内切核酸酶位点分析57

二、外显子／内含子边界分析57

三、开放阅读框分析57

四、转录起点、启动子以及转录因子结合位点分析57

第五章 基因突变技术59

第一节 体外基因突变59

一、体外基因突变的原理和应用59

二、体外基因突变的策略和步骤60

第二节 模式生物的基因组诱变63

一、基因组诱变的基本原理及应用63

二、利用ENU诱变的基本策略及流程64

三、利用转座子诱变的基本策略及流程65

第六章 核酸分子杂交68

第一节 核酸探针及其标记68

一、探针的种类及其选择69

二、核酸标记物及其选择69

三、核酸探针的标记方法71

四、标记探针的纯化74

第二节 Southern印迹杂交74

一、固相支持物与印迹方法的选择74

二、Southern印迹杂交的基本过程76

三、Southern印迹杂交的注意事项78

第三节 Northern印迹杂交78

一、Northern印迹杂交的基本过程79

二、Northern印迹杂交的注意事项79

第四节 其他核酸分子杂交80

一、斑点杂交与狭缝印迹杂交80

二、原位杂交80

三、液相分子杂交81

第七章 外源基因在原核细胞的表达83

第一节 常用表达系统及其选择84

一、大肠埃希菌表达系统84

二、芽胞杆菌表达系统86

三、链霉菌表达系统86

第二节 外源基因的表达和鉴定87

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点87

二、包含体的形成、变性与复性87

三、蛋白质在原核细胞表达的调控88

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定89

第三节 外源基因表达条件和优化89

一、表达载体的优化设计与选择89

二、增加mRNA的稳定性90

三、提高外源蛋白的稳定性90

四、选择合适的宿主菌90

第四节 外源基因原核表达的基本操作90

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体91

二、工程菌的构建91

三、产物的表达与鉴定91

四、作为基因重组药物的样品检定92

第五节 无细胞表达系统92

一、无细胞表达系统的类型93

二、无细胞表达系统的操作93

三、无细胞表达系统的应用94

第八章 外源基因在真核细胞中的表达95

第一节 真核表达外源基因的系统和方式95

一、常用表达载体和宿主95

二、外源基因在真核细胞中表达的主要方式95

三、外源基因在真核细胞中表达的鉴定96

第二节 真核细胞基因导入方法96

一、物理方法96

二、化学方法96

三、病毒感染法97

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达97

一、常用的酵母细胞表达载体97

二、酵母表达系统中的宿主97

三、酵母系统表达外源蛋白质的相关技术操作98

第四节 外源基因在昆虫细胞中的表达99

一、常用的昆虫表达系统99

二、昆虫表达系统中的宿主及其特点99

三、昆虫系统表达外源蛋白质的主要步骤100

第五节 外源基因在哺乳动物细胞中的表达101

一、常用的哺乳动物细胞表达载体101

二、常用哺乳动物细胞表达的宿主102

三、哺乳动物细胞表达外源蛋白质产物的主要操作103

四、哺乳动物细胞表达系统用于制备和生产重组蛋白质产品104

第九章 蛋白质的分离纯化106

第一节 生物样品的预处理106

一、机械破碎法106

二、超声破碎法107

三、反复冻融法107

四、表面活性剂裂解及酶解法107

第二节 蛋白质样品的粗分离108

一、离心分离108

二、透析和超滤108

三、沉淀108

第三节 蛋白质的层析纯化109

一、凝胶过滤层析110

二、离子交换层析111

三、亲和层析115

四、疏水作用层析116

第四节 蛋白质的电泳分离117

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳117

二、等电聚焦电泳118

三、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳120

第五节 特殊蛋白质的分离纯化120

一、包含体蛋白质的提取和纯化120

二、膜蛋白的提取和纯化121

三、蛋白质的脱盐和浓缩121

四、蛋白质的干燥和保存121

第六节 蛋白质分离纯化的综合策略121

一、基于蛋白质来源的考虑121

二、基于纯化日的的考虑122

二、基于纯度和成本的考虑122

第十章 蛋白质的定性定量分析124

第一节 蛋白质分子量的测定124

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量124

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量126

三、质谱法测定蛋白质精确分子量127

第二节 蛋白质的等电点测定128

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理128

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作128

第三节 蛋白质总含量测定129

一、凯氏定氮法129

二、Lowry法129

三、二喹啉甲酸法131

四、考马斯亮蓝法131

五、紫外光谱吸收法132

第四节 特定蛋白质的定性和定量分析132

一、细胞可溶性蛋白质的含量测定132

二、细胞分泌蛋白的含量测定139

三、膜蛋白的含量测定141

第五节 蛋白质半衰期测定142

一、脉冲追踪标记法142

二、放线菌酮阻断法143

第十一章 蛋白质的化学修饰分析145

第一节 蛋白质磷酸化分析145

一、放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析146

二、抗磷酸化氨基酸抗体用于蛋白质磷酸化分析149

三、蛋白质磷酸化的规模化分析150

第二节 蛋白质糖基化分析151

一、酶解释放法鉴定糖蛋白151

二、糖基化抑制剂用于鉴定糖蛋白153

三、凝集素结合法富集和鉴定糖蛋白154

四、单糖放射性核素示踪法154

五、糖蛋白的规模化研究技术154

第三节 其他蛋白质共价修饰分析155

一、蛋白质泛素化分析155

二、组蛋白的乙酰化和甲基化分析157

第十二章 蛋白质的空间结构分析159

第一节 蛋白质空间结构解析的X-射线晶体学技术160

一、基本原理160

二、晶体结构解析步骤161

第二节 蛋白质溶液结构解析的核磁共振波谱学技术162

一、基本原理162

二、核磁共振溶液结构解析步骤163

第三节 蛋白质空间结构的低温电镜三维重构技术166

一、基本原理166

二、低温电镜三维重构解析步骤167

第四节 蛋白质空间结构预测及建模169

一、蛋白质二级结构预测169

二、蛋白质三级结构建模169

三、蛋白质复合体结构的分子对接170

第十三章 蛋白质相互作用研究技术171

第一节 酵母双杂交法171

一、酵母双杂交系统的基本原理和用途171

二、酵母双杂交的主要实验步骤173

三、酵母双杂交系统中的常见问题与解决方案176

四、逆向双杂交系统和三杂交系统177

第二节 标签融合蛋白结合实验177

一、标签融合蛋白结合实验基本步骤177

二、标签融合蛋白结合实验常见问题的解决与改进178

第三节 免疫共沉淀分析179

一、基本原理和主要步骤179

二、几种特殊的免疫共沉淀技术180

三、免疫共沉淀的常见问题及解决办法181

第四节 物理学方法研究蛋白质-蛋白质相互作用182

一、荧光共振能量转移技术182

二、共振光散射技术和表面等离子共振技术185

三、共定位荧光染色技术187

第五节 蛋白质-蛋白质相互作用预测方法189

第十四章 蛋白质组学研究相关技术191

第一节 基于双向电泳-质谱的蛋白质组研究策略191

一、双向凝胶电泳191

二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定蛋白质193

第二节 基于多维层析-质谱的蛋白质组研究策略194

一、蛋白质样品制备与酶解194

二、肽混合物层析分离技术及进展195

三、电喷雾串联质谱鉴定蛋白质196

第三节 定量蛋白质组学研究技术196

一、荧光双向差异凝胶电泳技术197

二、细胞培养氨基酸代谢稳定核素标记技术197

三、核素辅助多重化学标记技术197

四、无标记定量技术198

五、基于质谱和核素标记辅助的绝对定量技术198

第四节 翻译后修饰蛋白质组研究技术199

一、翻译后修饰蛋白质富集与分离技术199

二、翻译后修饰蛋白质质谱鉴定技术200

第五节 蛋白质组学数据分析工具200

一、质谱数据鉴定、分析方法和工具200

二、蛋白质组数据功能注释与分析方法203

三、蛋白质组整合软件包203

第十五章 物质代谢与代谢组学研究相关技术205

第一节 代谢途径中的关键酶活性和代谢产物分析205

一、葡萄糖代谢关键酶活性和代谢产物分析206

二、脂肪代谢产物分析209

三、氨基酸代谢产物分析210

四、活性氧自由基和清除体系活性分析211

第二节 代谢途径物流分析211

一、葡萄糖摄取能力分析及意义212

二、细胞氧耗分析212

三、细胞内pH值分析212

四、ATP含量分析213

五、CO2含量分析213

六、线粒体代谢状态分析213

第三节 代谢组学研究214

一、代谢组学研究对象和应用领域215

二、代谢组研究方法215

第十六章 基因表达谱分析218

第一节 基因表达谱分析的基本方法218

一、基因芯片技术219

二、基因表达系列分析219

三、用于表达谱分析的基因测序技术220

第二节 基因芯片的原理及应用221

一、基因芯片的工作原理221

二、基因芯片技术的基本流程222

三、基因芯片的应用224

第三节 基因芯片的数据挖掘225

一、生物信息学数据库225

二、基因芯片数据挖掘的常用方法226

第四节 蛋白质芯片的原理及应用227

一、蛋白质芯片的原理和实验流程228

二、蛋白质芯片的分类及应用228

第十七章 基因转录调控分析230

第一节 转录调节蛋白与DNA的结合分析230

一、凝胶迁移或电泳迁移率实验230

二、染色质免疫沉淀技术233

第二节 启动子转录活性分析235

一、报告基因技术235

二、核实时转录分析技术238

三、 cDNA的5′-端快速扩增技术239

四、基于Ga14的DNA结合蛋白分析技术240

第三节 DNA甲基化分析240

一、甲基化特异性PC R241

二、亚硫酸盐修饰后基因组测序243

三、DNA甲基化检测的其他方法244

第四节 芯片技术在基因表达调控研究中的应用244

一、染色质免疫共沉淀-芯片技术245

二、染色质免疫共沉淀-序列分析技术245

三、染色质构象捕获技术245

第十八章 非编码RNA研究策略与方法247

第一节 miRNA的研究策略及相关技术247

一、miRNA的发现与克隆247

二、miRNA定量检测方法及其选择248

三、miRNA靶基因的预测与证实252

四、miRNA的功能研究253

第二节 siRNA的设计与应用256

一、应用siRNA的目的与原理256

二、siRNA的设计与合成257

三、siRNA的体内外递送方式257

第三节 长链非编码RNA的研究策略及相关技术258

一、IncRNA与蛋白质相互作用的研究方法258

二、IncRNA的生物信息学研究方法260

第十九章 疾病相关基因的鉴定和分析261

第一节 鉴定和分析疾病相关基因的策略261

一、疾病相关基因鉴定的基本原则261

二、DNA标记的概念261

三、连锁分析进行基因定位262

四、关联分析262

五、动物模型263

第二节 基因分型263

一、SNP分型263

二、STR分型265

三、CNV分型266

第三节 突变基因的检测267

一、以PCR为基础的检测方法267

二、以核酸杂交为基础的检测方法268

第二十章 遗传修饰动物的设计和应用270

第一节 小鼠实验的一般要求270

一、小鼠实验室的建立270

二、小鼠的基本饲养条件271

三、小鼠的日常管理271

四、小鼠培育272

第二节 转基因小鼠272

一、转基因载体的构建273

二、受精卵的显微注射和移植274

三、转基因小鼠的鉴定和进一步培育276

四、转基因小鼠的表型分析277

第三节 基因剔除小鼠277

一、基因剔除载体的设计和构建278

二、在ES细胞进行基因打靶280

三、ES细胞注射入囊胚和囊胚的移植283

四、基因剔除小鼠的基因型和表型分析283

第二十一章 基因功能的研究策略284

第一节 从分子水平研究基因产物的功能特点285

一、网络数据可用于蛋白质功能的预测285

二、细胞内定位为基因表达产物的功能提供基本线索285

三、基因表达的定性定量分析是基因功能及其调控的重要数据286

四、定点突变是蛋白质功能的重要证据287

五、相互作用分子是蛋白质功能的重要提示287

第二节 从细胞水平研究基因产物的作用机制287

一、表达和纯化蛋白质作为细胞调节的刺激信号287

二、在细胞内过表达特定基因以研究其功能287

三、通过降低基因的表达水平分析基因表达产物在细胞中的作用288

四、通过下游分子验证基因表达产物的功能289

第三节 从整体水平研究基因产物的生物学效应289

一、基因表达产物的体内分布特征289

二、基因在生理或病理过程中的表达分析289

三、基因敲除与敲入290

四、体内表达基因290

附录Ⅰ分子生物学实验设计中的常见错误291

附录Ⅱ分子生物学实验微量操作技巧295

附录Ⅲ 分子生物学实验教学实施方案298

实验一BCA法测定蛋白质的含量298

实验二 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳299

实验三 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化300

实验四 组织DNA与RNA的分离与提取301

实验五 碱裂解法提取质粒DNA302

实验六 紫外分光光度法测定核酸含量303

实验七 聚合酶链反应303

实验八DNA重组304

实验九 蛋白质印迹305

附录Ⅳ分子生物学实验资料参考307

中英文名词对照索引326