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1基因拷贝数量变化的高精度分析1

1.1 简介1

1.2 方法和途径2

1.2.1 寡核苷酸比较基因组杂交（aCGH）芯片2

1.2.2 单核苷酸多态性比较基因组杂交（aCGH）芯片13

1.2.3 多重连接探针扩增17

1.3 疑难解答25

参考文献26

2遗传图谱中的多态性标记识别29

2.1 简介29

2.2 方法和途径30

2.2.1 基因变异的知识库30

2.2.2 基因变异的靶向重测序31

2.3 疑难解答40

2.3.1 引物设计40

2.3.2 PCR扩增41

2.3.3 二进制文件的使用41

2.3.4 Phred/Phrap软件41

参考文献41

3基于SNP芯片的基因分型和杂合性缺失分析44

3.1 简介44

3.2 方法和途径44

3.2.1 芯片44

3.2.2 基因分型45

3.2.3 连锁关联分析45

3.2.4 甲醛固定石蜡包埋组织46

3.2.5 杂合性缺失52

3.3 疑难解答56

参考文献57

4复杂性状的基因定位60

4.1 简介60

4.2 方法和途径61

4.2.1 关联分析方法：随机样本61

4.2.2 关联方法：基于家系样本72

4.2.3 连锁分析：使用LOD值作为参数的分析方法73

4.2.4 连锁分析：非参数方法74

4.2.5 总结75

4.3 疑难解答75

4.3.1 合并数据集75

参考文献76

5针对单细胞敏感性的RNA扩增技术82

5.1 简介82

5.1.1 RNA扩增的目的82

5.1.2 扩增的方法84

5.2 方法和途径89

5.2.1 T7RNA聚合酶的体外转录89

5.2.2 全局RT-PCR96

5.3 疑难解答103

参考文献104

6表达谱分析的实时定量聚合酶链反应技术107

6.1 简介107

6.2 方法和途径108

6.2.1 样本筛选108

6.2.2 提取RNA109

6.2.3 临床样本和环境样本112

6.2.4 逆转录114

6.2.5 SYBR Green Ⅰ染料检测的荧光定量PCR118

6.2.6 寡核苷酸探针标记的定量PCR122

6.2.7 定量方法124

6.2.8 实时定量PCR的标准化127

6.3 疑难解答127

6.3.1 未扩增、扩增量少、扩增起步晚127

6.3.2 缺少模板组或阴性对照组130

6.3.3 无逆转录酶对照组130

6.3.4 形成引物二聚体131

6.3.5 SYBR Green Ⅰ溶解曲线出现多峰131

6.3.6 在样本重复实验3次，至少5倍对数稀释情况下，相关系数＜0.9 8，其标准曲线不可信131

6.3.7 不稳定的扩增曲线图或大幅度的井间变化131

参考文献132

7哺乳动物细胞中的基因表达137

7.1 简介137

7.1.1 人工染色体和转基因技术138

7.1.2 基因转移和表达139

7.1.3 位置效应和核染色质139

7.1.4 组织特异性调控元件139

7.1.5 持续表达和染色质绝缘体139

7.2 方法和途径140

7.2.1 哺乳动物细胞的位点特异性染色体重组140

7.2.2 质粒要求142

7.2.3 染色体转移144

7.3 疑难解答149

参考文献149

8酵母双杂交在分析大量蛋白质相互作用中的应用152

8.1 概述152

8.2 方法和途径154

8.2.1 建立大量“诱饵”或“猎物”蛋白克隆154

8.2.2 生成兼容性重组插入用于缺口修复克隆156

8.2.3 缺口修复反应157

8.2.4 阳性转化株鉴定159

8.2.5 酵母菌落PCR159

8.2.6 “诱饵”与“猎物”克隆自激活检测161

8.2.7 靶向矩阵法Y2 H筛选162

8.3 疑难解答166

参考文献166

9蛋白质功能预测168

9.1 引言168

9.2 方法和途径168

9.2.1 注释策略169

9.2.2 多个蛋白质识别系统的应用171

9.2.3 序列同源性172

9.2.4 系统发生关系175

9.2.5 序列衍生的功能和化学性质177

9.2.6 蛋白质-蛋白质相互作用图谱178

9.3 故障排查180

参考文献181

10通过基因工程小鼠阐释基因功能186

10.1 引言186

10.2 方法和途径187

10.2.1 小鼠目标基因剔除原理187

10.2.2 小鼠基因打靶策略189

10.2.3 通过重组工程从BAC中获得DNA191

10.2.4 胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞培养195

10.2.5 嵌合体配对和下游的应用215

10.3 疑难解答216

参考文献217

11基因转移的载体系统220

11.1 引言220

11.2 方法和途径220

11.2.1 理想的基因治疗载体220

11.2.2 质粒设计222

11.2.3 病毒载体222

11.2.4 非病毒DNA载体232

11.2.5 鉴定非病毒载体的物理性质235

11.2.6 优化体外基因传递236

11.2.7 优化方案239

11.2.8 报告基因和分析240

11.2.9 细胞毒性分析240

11.2.1 0非病毒载体的未来发展240

11.3 疑难解答241

11.3.1 一般问题241

参考文献242

12基因治疗策略：构建AAV特洛伊木马249

12.1 简介249

12.1.1 基因治疗的常规策略：基本方法249

12.1.2 基因治疗策略：基因转染细胞253

12.1.3 病毒载体254

12.1.4 重组AAV病毒的生产、纯化和滴度检测256

12.2 方法和途径257

12.3 疑难解答267

参考文献267

13蛋白质组学技术简介270

13.1 简介270

13.2 方法和途径271

13.2.1 基于凝胶的策略271

13.2.2 LC/MS策略274

13.2.3 基质辅助激光解吸电离（MALDI）成像和概览276

13.3 故障诊断277

13.3.1 若干分解出来的特征和修饰277

13.3.2 样品消耗、蛋白质识别及覆盖深度278

13.3.3 统计强度279

13.3.4 结论279

参考文献280

索引284