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第一章　基因工程概述1

第一节　基因操作与基因工程1

一、基因操作与基因工程的关系1

二、基因工程的诞生与发展2

第二节　基因工程是生物科学发展的必然产物4

一、基因是基因重组的物质基础4

二、DNA的结构和功能5

三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展7

第三节　基因的结构——基因操作的理论基础9

四、基因工程的内容9

一、基因的结构组成对基因操作的影响10

二、基因克隆的通用策略11

第一篇　基因操作原理15

第二章　分子克隆工具酶15

第一节　限制性内切酶15

一、限制与修饰15

二、限制酶识别的序列18

三、限制酶产生的末端19

四、DNA末端长度对限制酶切割的影响23

六、酶切反应条件24

五、位点偏爱24

七、星星活性26

八、单链DNA的切割26

九、酶切位点的引入26

十、影响酶活性的因素27

十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性27

第二节 甲基化酶28

一、甲基化酶的种类28

二、依赖于甲基化的限制系统28

第三节　DNA聚合酶29

三、甲基化对限制酶切的影响29

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ30

二、Klenow DNA聚合酶31

三、T4噬菌体DNA聚合酶31

四、T7噬菌体DNA聚合酶32

五、耐热DNA聚合酶32

六、反转录酶32

七、末端转移酶33

第四节　其他分子克隆工具酶33

一、依赖于DNA的RNA聚合酶33

二、连接酶34

四、碱性磷酸酶35

五、核酸酶35

三、T4多核苷酸激酶35

六、核酸酶抑制剂36

七、琼脂糖酶37

八、DNA结合蛋白37

九、其他酶37

第三章　分子克隆载体39

第一节　质粒载体39

一、质粒的基本特性39

二、标记基因41

三、质粒载体的种类43

一、λ噬菌体的分子生物学46

第二节　λ噬菌体载体46

二、λ噬菌体载体的选择标记51

三、代表性λ噬菌体载体52

四、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤57

第三节 单链丝状噬菌体载体60

一、M13噬菌体的生物学60

二、M13噬菌体载体62

三、M13噬菌体载体的宿主菌64

四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题66

五、噬菌粒67

六、M13KO7辅助噬菌体68

第四章　人工染色体载体70

第一节　黏粒载体71

一、黏粒的结构特征和用途71

二、黏粒载体的工作原理71

三、黏粒克隆载体72

四、黏粒文库的扩增和贮存75

五、构建黏粒文库应注意的问题75

第二节　酵母人工染色体载体76

一、YAC载体的复制元件和标记基因77

二、YAC载体的工作原理77

二、BAC载体工作原理79

一、BAC载体及其结构组成79

第三节　细菌人工染色体载体79

第四节　P1噬菌体载体和P1人工染色体载体80

一、P1噬菌体的分子遗传特征80

二、P1噬菌体载体81

三、P1人工染色体载体84

第五章　表达载体86

第一节　大肠杆菌表达载体86

一、大肠杆菌表达载体的结构86

二、利用T7噬菌体启动子的表达载体88

三、表达融合蛋白的表达载体90

四、表达产物的纯化93

一、大肠杆菌／革兰氏阳性细菌穿梭载体94

第二节　穿梭载体94

二、大肠杆菌／酵母菌穿梭载体95

三、其他穿梭载体95

第三节　整合载体95

一、基因插入／基因敲除95

二、随机插入突变载体96

第六章　基因操作中大分子的分离和分析100

第一节　DNA的分离、检测和纯化100

一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化100

二、DNA的琼脂糖凝胶电泳102

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳102

四、脉冲场凝胶电泳103

五、DNA片段的纯化104

第二节　RNA的分离、检测和纯化105

一、控制潜在RNA酶的活性105

二、RNA的抽提和纯化106

三、mRNA的纯化106

四、RNA的电泳检测107

第三节　分子杂交107

一、Southern杂交108

二、Northern杂交108

三、Western杂交108

五、探针的标记109

四、其他分子杂交109

一、RNA的S1核酸酶作图112

二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点112

第四节 RNA作图和端点分析112

三、引物延伸法分析mRNA的端点113

第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌115

一、CaCl2转化法115

二、电转化法115

第七章　基因芯片技术118

第一节　生物芯片简介118

一、生物芯片的定义118

三、基因芯片技术的发展史119

二、基因芯片分析流程119

四、基因芯片技术的特点120

第二节　生物芯片的分类120

一、按载体材料分类120

二、按点样方式分类120

三、按芯片固定的生物分子类型分类121

四、按芯片使用功能分类121

第三节　基因芯片的制作122

一、DNA样品的来源122

二、生物芯片的制作方法123

三、制作生物芯片常用的工具124

四、DNA分子在刚性表面的固定125

第四节 基因芯片的杂交及结果分析126

一、探针的标记126

二、杂交127

三、芯片结果读取与扫描仪128

四、生物芯片的软件系统与数据处理128

第五节　基因芯片的应用129

一、基因表达分析129

三、杂交测序130

四、核酸和蛋白质相互作用的研究130

二、基因型及多态性分析130

五、疾病的诊断与治疗131

六、药物开发131

七、在营养与食品卫生领域的应用131

八、在环境科学领域中的应用131

第八章　PCR技术及其应用133

第一节　PCR技术原理和工作方式133

一、PCR的基本原理133

二、PCR反应体系134

三、PCR反应程序137

第二节　PCR产物的克隆138

一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点138

二、A/T克隆法139

三、平末端DNA片段的克隆140

四、长片段DNA的PCR扩增142

第三节 PCR扩增未知DNA片段142

一、反向PCR143

二、利用接头的PCR144

三、热不对称交错PCR144

第四节　与反转录相关的PCR146

一、cDNA末端的快速扩增146

二、差异显示PCR148

一、多重PCR149

第五节　PCR产生DNA指纹149

二、随机扩增多态性DNA150

三、扩增片段长度多态性150

第六节 实时定量PCR151

一、实时荧光定量PCR的定量方式151

二、荧光标记方式152

第九章 DNA序列分析155

第一节 Maxam-Gilbert化学降解法155

一、基本原理155

二、化学降解测序法的基本步骤155

一、基本原理157

第二节　Sanger双脱氧链终止法157

四、化学降解测序法的应用157

三、化学修饰试剂157

二、序列分析的基本步骤160

三、序列分析的工作模式161

第三节　DNA片段序列测定的策略163

一、通用引物指导未知序列的测定163

二、引物步移163

三、随机克隆测序163

四、缺失克隆测序164

一、序列分析和生物信息学的应用165

二、基因数据库和分析工具165

分析165

第四节 核苷酸序列的生物信息165

第十章　DNA诱变168

第一节　随机诱变168

一、错误掺入诱变169

二、盒式诱变170

三、增变菌株的诱变作用171

四、化学诱变171

第二节　DNA体外重组173

一、DNA洗牌法173

二、交错延伸重组174

三、随机引发重组175

第三节　寡核苷酸介导的定点诱变176

一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程176

二、诱变寡核苷酸的设计176

三、经典DNA定点诱变177

四、PCR介导的定点诱变178

五、野生型DNA的筛选排除182

第四节　嵌套缺失183

一、嵌套缺失的制备183

二、嵌套缺失的应用184

第十一章　DNA文库的构建和目的基因的筛选187

第一节　基因组DNA文库的构建188

一、基因组DNA文库的类型和发展188

二、文库的代表性和随机性189

三、基因组DNA文库的构建流程190

第二节　cDNA文库的构建192

一、cDNA文库的特征和发展192

二、cDNA文库的构建193

三、cDNA文库均一化处理198

四、扣除杂交cDNA文库199

五、全长cDNA文库202

六、其他cDNA文库203

第三节　基因克隆的筛选策略205

一、表型筛选法206

二、杂交筛选和PCR筛选206

三、免疫筛选206

四、酵母双杂交系统207

五、克隆基因的验证和分析208

第四节　DNA文库的保存208

第一节 基因组遗传图谱的构建211

一、遗传作图标记211

第十二章　基因组研究技术211

二、遗传作图的方法212

第二节 基因组物理图谱的构建213

一、限制性作图213

二、DNA大片段重叠克隆的基因组作图213

三、荧光标记原位杂交作图214

四、序列标签位点作图214

第三节　基因组测序215

一、大规模基因组测序方法学改进215

二、基因组DNA序列的确定215

第四节　基因组功能分析220

一、鉴定基因组序列中的基因220

三、人类基因组测序220

二、基因功能的确定221

三、基因组功能体现222

第五节　基因组工程223

一、基于Cre-loxP重组系统的基因组工程223

二、病毒基因组工程223

第二篇　基因工程应用229

第十三章　植物基因工程229

第一节　植物基因工程的发展现状229

第二节　植物基因工程方法230

一、原生质体介导法231

二、基因枪法233

三、根癌农杆菌介导法235

四、基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较239

第三节　转化子细胞的筛选240

一、植物基因工程中的选择基因240

二、报告基因240

第四节　转化体的鉴定与证实241

一、PCR检测外源基因的整合242

二、Southern杂交检测外源基因的整合242

三、RT-PCR检测外源基因的表达242

第五节 植物基因工程研究的应用和展望243

一、抗性基因工程243

四、Northern杂交检测外源基因的表达243

五、Western杂交检测外源基因表达的产物243

二、植物品质改良基因工程246

三、植物杂种优势的利用247

四、植物代谢工程247

第十四章 动物基因工程249

第一节 动物基因工程的发展现状与趋势249

一、转基因方法的升级换代250

二、转基因动物打破了传统的农业生产格局251

第二节 转基因动物技术252

一、动物基因工程载体252

三、转基因动物及其产品的生物安全性252

二、基因转移技术260

第三节 转基因动物制备262

一、转基因动物的制备程序262

二、转基因鉴定266

三、表达水平检测268

四、转基因动物传代与检测269

第四节　转基因动物的应用与未来270

一、转基因动物的应用270

二、转基因动物的生物安全性271

三、动物转基因的未来272

一、酵母基因工程的优点274

第十五章 酵母基因工程274

第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势274

二、酵母基因工程的发展现状275

三、酵母基因工程的发展趋势276

第二节　酵母表达系统277

一、酵母表达系统概述277

二、常用酵母表达系统279

第三节　酵母基因工程的应用285

一、酵母基因工程的应用情况285

二、酵母基因工程的应用举例287

一、细菌基因工程的发展简史290

二、细菌基因工程的发展现状290

第一节　细菌基因工程的发展现状和发展趋势290

第十六章　细菌基因工程290

三、细菌基因工程的发展趋势及前景展望292

第二节　细菌基因工程的表达系统293

一、细菌基因工程的表达系统293

二、表达载体构建原则293

三、外源基因表达的方式294

四、常见细菌表达系统295

第三节　细菌基因工程的应用298

一、农业领域的基因工程细菌298

二、食品和工业基因工程菌302

三、重组DNA技术生产医用抗生素307

四、环境微生物基因工程菌的应用309

第十七章　病毒基因工程314

第一节　病毒载体315

一、动物病毒载体315

二、植物病毒载体323

三、噬菌体载体324

第二节 病毒与基因工程324

一、基因工程病毒疫苗325

二、病毒与基因治疗326

三、病毒与生物防治328

第十八章 医药基因工程333

第一节　基因工程药物的开发状况333

一、基因工程药物的分类333

二、基因工程药物的发展334

三、基因工程药物的产业化状况335

第二节　基因工程蛋白和多肽药物336

一、基因工程胰岛素336

二、基因工程人红细胞生成素337

三、基因工程干扰素338

四、基因工程疫苗339

一、抗体的结构341

第三节　基因工程抗体341

五、基因工程抗体341

二、天然抗体的局限性342

三、基因工程抗体的种类343

第四节　核酸类药物346

一、反义核酸药物346

二、核酸疫苗348

三、RNA干扰350

四、基因治疗351

第一节　基因工程产品的安全性争论354

一、DNA重组的安全性争论354

第十九章　基因工程产品的安全及其管理354

二、基因工程产品的安全性争论355

三、与基因工程产品的安全性有关的重要事件355

第二节　基因工程产品与人类356

一、基因工程产品与人类健康356

二、基因工程产品与农业生产357

三、基因工程产品与生态平衡357

第三节　基因工程产品的安全性管理357

一、基因工程产品的安全性管理类型358

二、中国基因工程产品的安全性管理358

第四节　基因工程技术及其产品的发展前景359

索引361