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第1章 蛋白质微阵列的原理1

1.1 引言1

1.2　蛋白质基础知识2

1.3　实验要求5

1.4　蛋白质微阵列的应用8

1.4.1　表达谱分析8

1.4.2　蛋白质间相互作用8

1.4.3　药物8

1.4.4　诊断9

1.5　蛋白质微阵列的未来9

致谢10

参考文献10

第2章 蛋白质微阵列的制作及检测新策略13

2.1 引言13

2.2 固定策略14

2.2.1　生物素-亲和素标记系统14

2.2.2　体外蛋白质生物素化14

2.2.3　基于PCR的细胞外蛋白质生物素化26

2.2.4　细胞内蛋白质生物素化26

2.2.5 由N末端半胱氨酸固定蛋白质27

2.3　检测对策30

2.3.1　结构依赖探针用于蛋白质活性的检测31

2.3.2　抑制剂结构依赖探针的应用31

2.3.3　用荧光底物作蛋白质活性图（分析酶底物谱）37

2.3.4　微阵列的装配39

2.3.5　用荧光小分子微阵列评估酶活性40

2.4　结论42

致谢42

参考文献42

第3章 蛋白质微阵列的操作指导：检测系统、方法学及其演变45

3.1 引言45

3.2　常规蛋白质检测45

3.3　商业化的抗体微阵列46

3.4　如何制作和使用抗体微阵列49

3.4.1　原材料49

3.4.2　基片制备51

3.4.3　点样51

3.4.4　结合反应52

3.4.5　扫描52

3.5　蛋白质微阵列的亲和性试剂54

3.6　亲和性蛋白质微阵列分析法的高级技术（Barry's竞争性检测）55

3.7　肽组学56

3.8　结论58

参考文献59

第4章　蛋白质-糖类相互作用的高通量分析微阵列60

4.1　引言：糖类微阵列的重要性60

4.2　各种糖类微阵列类型的分析61

4.2.1　糖类微阵列的原位合成61

4.2.2　糖类微阵列的共价结合63

4.2.3　吸附微阵列63

4.3　吸附微阵列：MaxiSorp的研究65

4.4　用于噬菌体展示抗体筛选的MaxiSorp糖类微阵列68

4.5　结论和前景71

参考文献71

第5章 蛋白质微阵列：原理和限制73

5.1 引言73

5.2　为什么微阵列要做得小些？74

5.2.1　小芯片的结合反应更快75

5.2.2　减少探针溶液的损耗75

5.2.3　小芯片对测定技术可作较大的选择75

5.2.4　同位素方法的安全性76

5.2.5　节省材料76

5.2.6　在应用电泳检测法时小型微阵列可以快速进行热交换76

5.2.7　小型微阵列可使整个芯片表面维持稳定的力76

5.3　微阵列的生产技术77

5.3.1　原位合成77

5.3.2　点样技术77

5.3.3　微针点样及其他技术79

5.3.4　喷墨法80

5.3.5　近距离电喷点样80

5.3.6　远距离电喷点样80

5.3.7　微接触打印点样法82

5.3.8　光控蛋白结合法82

5.4　蛋白质在微阵列上的固定83

5.4.1　分析物的进入途径84

5.4.2　固定蛋白的表面浓度84

5.4.3　蛋白质与基片表面的共价连接85

5.4.4　非特异性结合85

5.5　微阵列生产中蛋白质功能的保护86

5.5.1　蛋白质结构的保护86

5.5.2　蛋白质功能的保护86

5.5.3　干蛋白质斑点的固定87

5.5.4　固定过程的保护89

5.5.5　蛋白质芯片的储存89

5.6　微阵列试验的物理学限制因素90

5.6.1　反应动力学90

5.6.2　亲和性的限制91

5.6.3　本底92

5.7　主动微阵列试验方法92

5.7.1 主动洗涤以降低背景和提高检测灵敏度93

5.8　测定方法93

5.8.1　荧光技术94

5.8.2　作为标记物的功能性磁珠97

5.8.3　SPR及其相关技术97

5.8.4　扫描探针显微术98

5.8.5　质谱分析99

5.9　结论101

参考文献101

第6章 蛋白质结构域微阵列在系统蛋白质组学研究中的应用107

6.1 引言107

6.2　蛋白质结构域109

6.3　制备蛋白质结构域微阵列110

6.3.1　结构域克隆与重组蛋白纯化110

6.3.2　蛋白质结构域微阵列点样110

6.3.3　蛋白质结构域微阵列的实际应用112

6.3.4　肽模序与固相蛋白质结构域特异性结合112

6.3.5　全细胞溶解物中单一蛋白结合谱检测114

6.4　蛋白质结构域微阵列的应用前景116

6.4.1　用全蛋白质组作为探针116

6.4.2　翻译后修饰的详细分析116

致谢116

参考文献117

第7章 应用重组蛋白质组文库进行微阵列比色分析在类风湿关节炎中的应用119

7.1　引言119

7.2　样本准备122

7.3　基片123

7.4　点样系统124

7.5　校准标志物和串联空白125

7.6　微阵列处理125

7.7　扫描与定量127

7.8　数据分析128

7.9　结论与展望132

致谢133

参考文献133

附录：MMI自身抗体试验方案135

第8章 开发蛋白质微阵列的学术和商业问题137

8.1　引言137

8.2　制备141

8.2.1　抗体141

8.2.2　类抗体蛋白质141

8.2.3　单链寡核苷酸（适体）142

8.2.4　分子印迹聚合物143

8.2.5　合成肽143

8.3　蛋白质的大量生产144

8.3.1　重组生物体144

8.3.2　无细胞蛋白质表达144

8.4 固定145

8.4.1　简单随机吸附145

8.4.2　蛋白质表面基团的修饰145

8.4.3　水凝胶和其他表面包被物146

8.4.4　蛋白质交联146

8.4.5　定向固定化146

8.4.6 蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L146

8.4.7　链霉亲和素146

8.4.8　糖组分147

8.4.9　氮川三乙酸147

8.4.10　核酸147

8.5　检测148

8.5.1　激光扫描148

8.5.2　酶联免疫吸附分析148

8.5.3　磷光成像148

8.5.4　原子力显微成像技术149

8.5.5　纳米粒子149

8.5.6　循环扩增149

8.6　应用149

8.6.1　蛋白质表达图谱149

8.6.2　疾病标志150

8.6.3　人类肿瘤150

8.6.4　癌细胞表型151

8.6.5　细胞因子151

8.6.6　感染性疾病151

8.6.7　过敏症151

8.6.8　自身免疫性疾病152

8.7　蛋白质相互作用的探讨152

8.7.1　蛋白酶152

8.7.2　蛋白激酶152

8.7.3　功能域微阵列153

8.7.4　药物开发153

8.8　结论154

参考文献155

第9章 应用ArrayTubeTM抗体微阵列分析蛋白质及蛋白质的修饰159

9.1 引言159

9.2　ArrayTubeTM系统160

9.2.1　抗体打印点样160

9.2.2　蛋白质制备161

9.2.3　细胞蛋白的生物素标记161

9.2.4　蛋白质提取物与ArrayTubeTM抗体微阵列的反应162

9.2.5　银染色162

9.3　数据分析163

9.3.1　蛋白质磷酸化分析163

9.4　结论165

致谢166

参考文献166

附录167

附录A：蛋白质提取物制备167

附录B：生物素标记167

附录C：与Array TubeTM抗体微阵列进行反应167

附录D：银染色168

附录E：缓冲液和试剂168

第10章 非接触式点样法在蛋白质微阵列中的应用169

10.1 引言169

10.2　非接触式点样171

10.2.1　基片表面与点样针尖的相互作用172

10.2.2 点样速度172

10.2.3　微阵列点样模式的灵活性173

10.2.4　微滴体积173

10.3　非接触式点样技术的现状174

10.3.1　压电174

10.3.2　螺线管174

10.3.3　混合螺线管176

10.3.4 TopSpot点样系统178

10.4　工艺方面的考虑180

10.4.1　液滴与喷嘴的相互作用180

10.4.2　气泡180

10.4.3　静电181

10.4.4　吸液稀释181

10.4.5　几何排列问题182

10.4.6　喷嘴清洗与调试182

10.4.7 图像观察182

10.5 总结182

10.5.1　研究与开发182

10.5.2　生产183

10.5.3　商业应用183

10.6　展望184

致谢184

参考文献184

第11章 BioLPTM：高速、高效蛋白质打印点样186

11.1 引言186

11.2　设备和初期非生物材料的初步研究188

11.3　生物激光印迹技术进行蛋白质印迹190

11.3.1　转移液体的原理190

11.3.2　平板表面和微孔内的点样191

11.3.3　蛋白质点样点直径和体积的测量192

11.3.4　蛋白质信号的检测194

11.4　结论195

致谢195

参考文献195

第12章 蛋白质微阵列表达谱平台的捕获剂：生物芯片中的“生物”197

12.1 引言197

12.2　每个探针蛋白质所需的抗体数量和种类198

12.3　蛋白质结合剂的类型202

12.3.1　常用的单克隆抗体和多克隆抗体202

12.3.2　重组抗体文库的体外筛选204

12.3.3　人工合成的蛋白质结合剂207

12.4　结合剂的筛选和确证208

12.5　抗原制备210

12.6　基于选择性抗体的蛋白质发现212

12.7　结论213

致谢213

参考文献214

第13章 蛋白质芯片在过敏原特异性抗体谱系分析中的应用217

13.1 引言217

13.1.1　蛋白质微阵列的发展218

13.1.2　检测的进展219

13.1.3　蛋白质微阵列IgE抗体谱在过敏原诊断中的应用220

13.2　结果220

13.2.1 微阵列与UniCAP？检测IgE的相关性222

13.2.2　微阵列IgE测定的线性关系和检测范围226

13.2.3　过敏原特异性IgG谱系226

13.3　讨论227

13.3.1　蛋白质微阵列进展227

13.3.2　要克服的技术难点228

13.4　未来发展229

13.5　材料和方法231

13.5.1　生产重组过敏原玻璃微阵列231

13.5.2　过敏原微阵列分析231

13.5.3　微阵列IgE检测结果的分析232

13.5.4　荧光图像的获取及原始数据的产生233

13.5.5　数据转化方法233

13.5.6　总的质量控制234

13.5.7　单个位点的质量控制235

13.5.8　过敏原样品重复的质量控制236

13.6　检测报告236

13.6.1　过敏原特异性荧光强度临界值的确定236

13.6.2　计算IgE水平及RAST分级237

致谢237

参考文献237

第14章 蛋白质微阵列的固相支持及相关设备240

14.1 引言240

14.2　受体-配体反应的物理化学性质241

14.2.1　周围分析物理论241

14.3 固体支持物、扩散限制以及反应动力学244

14.4　蛋白质吸附和多分析物检测的灵敏度246

14.5　基片材料及其设计：应用和实践247

14.5.1　过滤膜和微孔板247

14.5.2　蛋白质微阵列芯片248

14.5.3　凝胶固定化合物的微阵列248

14.5.4　纳米池微阵列249

14.5.5　显微玻片微阵列249

14.5.6　颗粒微阵列249

14.5.7　Zeptosens蛋白质微阵列系统250

14.5.8　质谱分析用的纳米瓶阵列250

14.5.9　Ciphergen公司的ProteinChip？技术251

14.5.10　微阵列上天然蛋白的固定251

14.6　表面化学和交联251

14.6.1　总的考虑251

14.7　表面处理与包被253

14.7.1　PLL253

14.7.2　硅烷化表面254

14.7.3　低分子量交联剂255

14.7.4　蛋白质包被的表面［牛血清白蛋白，亲和素，链霉亲和素］256

14.7.5　进行表面处理的优点256

14.8　嫁接表面的包被和单层化258

14.8.1 PEG化（Pegylated）的表面258

14.8.2 自组装单分子层259

14.8.3　膜蛋白的表面载体260

14.9　三维表面260

14.9.1　凝胶表面260

14.9.2　滤膜包被261

14.9.3　多聚体包被261

14.10　亲和标签用于蛋白质固定262

14.10.1　精氨酸标签263

14.10.2　组氨酸标签263

14.10.3　S标签264

14.10.4　钙调素结合多肽264

14.10.5　PROfusionTM技术265

14.10.6 固定在链霉亲和素和亲和素表面265

14.10.7　全蛋白融合体266

14.11　结论267

参考文献268

第15章 蛋白质微阵列在生物传感器中的应用277

15.1　传感器和生物传感器简介277

15.2　单分析物生物传感器278

15.2.1 历史279

15.2.2　免疫传感器280

15.3　多分析物生物传感器282

15.3.1　单变量阵列与多变量阵列282

15.3.2　多分析物和生物传感器的微阵列技术284

15.4　蛋白质微阵列在生物传感器中的应用285

15.4.1　生物传感器的再利用289

15.4.2　反应物的稳定性291

15.5　结论291

参考文献292

第16章 蛋白质微阵列技术和纳米阵列技术295

16.1　引言295

16.2　蛋白质微阵列制备技术296

16.2.1　光化学方法296

16.2.2　接触式打印点样298

16.2.3　非接触式打印点样302

16.2.4　激光书写打印点样304

16.3　基片和表面化学处理307

16.3.1　基片材料307

16.3.2　表面化学处理308

16.4　标记与检测310

16.4.1　标记检测311

16.4.2　非标记检测311

16.5　蛋白质点形成的微流体技术315

16.5.1　表面性质316

16.5.2　几何设计317

16.5.3　液体的性质318

16.6　蛋白质微阵列的应用318

16.6.1　分析型蛋白质微阵列319

16.6.2　功能型蛋白质微阵列320

16.6.3　蛋白质的高通量生产320

16.6.4　功能型蛋白质微阵列的应用320

16.6.5　多肽阵列321

16.7　结论322

参考文献322

第17章 百万-密度级纳米阵列：新颖的抗体微阵列的挑战328

17.1 引言328

17.2　目标抗体要求329

17.3　蛋白质组学全面分析334

17.4　百万-密度级纳米阵列335

17.4.1　SinFabs在纳米阵列中的印迹336

17.4.2　纳米阵列上的抗原-抗体结合337

17.4.3　纳米阵列上的蛋白质组点样和分析338

17.5　结论339

致谢339

参考文献339

第18章 INFINITITM系统：一种自动化多重蛋白质微阵列平台342

18.1 引言342

18.2　蛋白质微阵列343

18.2.1 优点343

18.2.2　挑战343

18.3　抗体微阵列344

18.3.1 INFINITITM系统345

18.3.2　BioFilmChipTM微阵列345

18.3.3 INFINITITM分析仪347

18.3.4　IntellipacTM试剂管理模块347

18.3.5　操作347

18.3.6　检测系统347

18.4 INFINITITM系统分析细胞因子348

18.5　材料和方法349

18.5.1　抗体准备349

18.5.2　蛋白质微阵列349

18.5.3　IL-2夹心法测定荧光信号反应349

18.5.4　IL-2夹心法检测的特异性研究350

18.5.5 IL-2、IL-4和IFN-γ多重夹心法350

18.6　结果和讨论352

18.7　结论353

致谢353

参考文献353

第19章　分析动物及人类抗体反应的蛋白质微阵列技术355

19.1 引言355

19.2　蛋白质的翻译后修饰与免疫系统356

19.3 自身免疫疾病B细胞和T细胞反应的协调性357

19.4 自身抗体谱：潜在的应用358

19.5　多重免疫测定简史358

19.5.1　用于抗体谱分析的蛋白质抗原微阵列技术359

19.5.2　发现新抗原的微阵列技术363

19.6　结论363

致谢364

参考文献364

第20章　G蛋白偶联受体微阵列——新药研发的得力工具367

20.1　引言367

20.2　膜蛋白微阵列的基本技术368

20.3　膜蛋白微阵列的表面处理369

20.4　膜蛋白微阵列的制作370

20.5　利用GPCR微阵列进行“初步筛选”检测370

20.6 利用GPCR微阵列进行“二次筛选”检测373

20.7　结论374

致谢374

参考文献375

第21章　在蛋白质组水平分析病原微生物的免疫应答377

21.1　引言377

21.2　蛋白质微阵列技术379

21.3　用于分析抗体反应性的蛋白质芯片380

21.4　在全蛋白质组水平分析对微生物的免疫应答：机遇和挑战382

21.5 当前的应用和未来发展的方向386

21.6　结论387

参考文献387

第22章　蛋白质微阵列技术在药物学研究领域的发展389

22.1 蛋白质组学和蛋白质的多样性389

22.2　蛋白质组研究的方法概要390

22.3　蛋白质微阵列用于药物研发和质量控制391

22.4　生物成分的来源392

22.5　构建表达克隆392

22.6　是否需要标签394

22.7　重组蛋白表达394

22.8　蛋白质的纯化与固化396

22.9　用MS分析蛋白质微阵列397

22.10　药物靶多态变异体微阵列404

22.11　应用于糖蛋白指纹的凝集素微阵列405

22.12　U-c指纹技术406

22.13　讨论407

参考文献409

第23章 功能性蛋白质微阵列的发展和应用411

23.1 引言411

23.2　工序总览412

23.3　工作流程413

23.4　第一部分：克隆414

23.5　第二部分：蛋白质表达419

23.6　第三部分：蛋白质纯化421

23.7　第四部分：蛋白质微阵列生产422

23.8　第五部分：功能性蛋白质微阵列的应用423

23.8.1　蛋白质-蛋白质相互作用423

23.8.2　蛋白质与小分子相互作用425

23.9　酶活性测定426

23.9.1　其他用途426

23.9.2　未来应用427

参考文献428

第24章 用于蛋白质微阵列的工具430

24.1　建立蛋白质微阵列平台430

24.2　基础的建立：来自于DNA微阵列的经验430

24.3　对商业化的简短说明431

24.4　DNA与蛋白质432

24.5　蛋白质微阵列表面化学的方法学432

24.6　研究实例：遵循规则434

24.7　表面化学、样品以及试剂的稳定性436

24.8　将蛋白质打印到微阵列436

24.8.1　亲蛋白质特性438

24.8.2　微打点的针、板和样品储存438

24.8.3　样品分布和表面的关系439

24.9　打印点样缓冲液439

24.9.1　遵循规则441

24.10　SpotBot？适用于蛋白质微阵列的机器人441

24.11　蛋白质微阵列的检测442

24.11.1　SpotWareTM工作原理443

24.12　图像的采集445

24.13　原始数据的验证446

致谢448

参考文献449

索引450