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第一章 绪论1

第一节 基因工程的内容与应用1

一、基因工程的概念1

二、基因工程的技术流程1

三、基因工程的基本条件2

四、基因工程的技术策略3

五、基因工程的作用与影响4

第二节 基因工程的发展历程和理论基础5

一、基因工程的发展历程5

二、基因工程理论基础和技术支撑8

第三节 学习基因工程课程的意义和方法9

一、学习和研究基因工程的意义9

二、学习基因工程的方法10

思考题11

第二章 基因工程的酶学基础12

第一节 限制性内切核酸酶12

一、限制-修饰系统12

二、限制性内切核酸酶的类型13

三、限制性内切核酸酶的命名14

四、Ⅱ型限制内切核酸酶的基本特性14

五、影响限制性内切核酸酶活性的因素18

六、限制性内切核酸酶对DNA的消化作用19

第二节 DNA连接酶21

一、DNA连接酶的发现21

二、DNA连接酶的特点21

三、DNA连接酶的作用机理22

四、影响连接反应的因素23

第三节 DNA聚合酶和反转录酶25

一、DNA聚合酶25

二、反转录酶29

第四节 DNA修饰酶29

一、末端脱氧核苷酸转移酶29

二、T4多核苷酸激酶30

三、碱性磷酸酶31

第五节 外切核酸酶32

一、大肠杆菌外切核酸酶32

二、双链外切核酸酶33

第六节 单链内切核酸酶34

一、S1核酸酶34

二、Bal 31核酸酶34

三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ35

第七节 RNA酶36

一、核糖核酸酶A36

二、核糖核酸酶H36

三、核糖核酸酶T136

思考题37

第三章 载体38

第一节 克隆载体38

一、质粒载体38

二、噬菌体载体41

三、噬菌体-质粒杂合载体46

四、人工染色体及其应用48

第二节 表达载体50

一、质粒表达载体50

二、病毒表达载体55

三、大片段表达载体59

第三节 特殊用途的载体60

一、插入或定点整合突变载体60

二、启动子探针型表达载体61

三、RNAi载体62

思考题64

第四章 基因工程的主要技术及其原理65

第一节 DNA和RNA的提取和纯化65

一、DNA提取的基本原理与方法65

二、RNA提取的基本原理与方法68

三、DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定69

第二节 凝胶电泳70

一、琼脂糖凝胶电泳71

二、琼脂糖变性胶电泳72

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳72

四、脉冲电场凝胶电泳73

五、凝胶电泳中DNA的检测74

第三节 核酸和蛋白质的分子杂交74

一、探针的标记74

二、Southern杂交76

三、Northern杂交77

四、菌落（或噬菌斑）杂交77

五、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交78

六、Western杂交78

七、液相杂交79

第四节 聚合酶链式反应技术79

一、PCR技术原理79

二、PCR反应体系80

三、PCR技术的应用83

第五节 DNA序列分析86

一、Maxarn-Gilbert化学降解法86

二、Sanger双脱氧链终止法87

三、DNA的自动测序88

四、DNA的测序策略88

五、核苷酸序列的生物信息学分析89

第六节 基因定点诱变90

一、盒式诱变90

二、寡核苷酸引物诱变90

三、PCR诱变91

第七节 DNA与蛋白质互作分析92

一、酵母单杂交系统92

二、凝胶阻滞试验93

三、DNaseⅠ足迹试验94

四、DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析94

思考题95

第五章 目的基因的获得97

第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA97

一、已知序列基因的PCR扩增97

二、常规PCR衍生的几种基因克隆技术98

第二节 基因组文库的构建与基因分离104

一、基因组文库的类型104

二、构建基因组文库应满足的条件105

三、基因组文库的构建106

四、其他载体基因组文库的构建112

五、基因组文库的扩增筛选113

第三节 cDNA文库的构建与筛选116

一、cDNA文库的特征及发展116

二、构建cDNA文库应满足的条件117

三、cDNA文库的构建118

四、cDNA文库的筛选122

第四节 根据基因差异表达获得目的基因124

一、差异显示PCR124

二、cDNA代表性差异分析125

三、抑制性削减杂交126

四、RNA任意引物PCR127

第五节 基因的化学合成127

一、寡聚核苷酸单链的化学合成127

二、探针的化学合成128

三、连接子和接头的合成128

四、基因的半合成（酶促合成）128

五、全长基因化学合成128

思考题129

第六章 DNA重组的操作130

第一节 DNA的体外重组130

一、黏性末端的连接130

二、平末端的连接132

三、PCR产物的连接135

四、Gateway载体构建系统136

第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术139

一、重组DNA导入大肠杆菌的方法139

二、重组DNA导入真核细胞的方法143

三、转化率及其影响因素150

第三节 重组子的筛选与鉴定152

一、载体表型选择法152

二、根据插入基因的表型选择法153

三、DNA电泳检测法153

四、PCR检测法154

五、核酸杂交检测法154

六、免疫化学检测法154

七、DNA序列分析155

思考题156

第七章 外源基因的表达及其优化策略157

第一节 影响外源基因表达的因素157

一、阅读框架对转化基因表达的影响157

二、顺式作用元件对基因表达的影响157

三、翻译过程对表达的影响160

四、表达系统对表达产物的影响161

第二节 外源基因在原核细胞中的表达161

一、原核生物基因表达与调控的特点162

二、原核生物基因表达载体的组成特征162

三、原核生物基因表达的受体系统164

四、优化外源基因在原核细胞中表达的策略165

第三节 外源基因在真核细胞中的表达168

一、真核生物基因表达与调控的特点169

二、真核生物基因表达载体的组成特征169

三、真核表达的受体系统173

四、优化外源基因在真核细胞中表达的策略174

思考题176

第八章 外源基因表达产物的分离纯化177

第一节 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则177

一、纯化策略的制定177

二、层析类型的选择179

三、多种分离纯化技术的联合应用180

四、合适分离纯化介质的选择181

五、分离纯化过程的规模182

第二节 不同表达形式的蛋白质分离纯化183

一、分离纯化的一般步骤183

二、大肠杆菌表达的重组蛋白质的分离纯化190

三、哺乳动物细胞表达的重组蛋白质的分离纯化200

第三节 重组蛋白质的质量检测203

一、重组蛋白质的质量控制指标203

二、重组蛋白的质量检测项目与方法206

三、重组蛋白质的保存207

思考题207

第九章 基因工程的应用209

第一节 植物基因工程的应用209

一、植物基因工程技术流程209

二、植物基因工程的应用213

三、基因工程与常规育种相结合进行作物遗传改良221

第二节 动物基因工程的应用222

一、动物基因工程的技术流程222

二、动物基因工程的应用224

第三节 微生物基因工程的应用226

一、微生物基因工程的技术流程226

二、微生物基因工程的应用226

思考题232

第十章 基因工程及其产品安全性管理233

第一节 基因工程的安全性问题233

一、基因工程产品对人类健康的安全性233

二、基因工程对生态系统的安全性234

三、转基因生物与农业生产的安全性235

四、基因工程与伦理道德236

五、基因工程与动物权益保护238

第二节 基因工程的安全性评价239

一、基因工程生态安全性评价239

二、基因工程食品安全性评价240

第三节 基因工程安全管理244

一、生物安全管理244

二、中国转基因生物的安全管理246

思考题248

主要参考文献249