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第一章　绪论1

第一节　基因与基因工程的概念1

一、基因1

二、人类基因组计划5

三、基因工程的概念6

第二节　基因工程发展史7

第三节　基因工程的巨大意义8

第四节　生物技术与基因工程10

第五节 中国基因工程的现状与前景10

第六节　基因工程的安全性问题13

第七节　我国的《基因工程安全管理办法》15

第八节　基因工程的基本过程16

第九节　基因工程上游和下游16

第十节　基因工程的上游工程——基因克隆17

第十一节　基因工程的流程17

复习思考题18

第二章　各种工具酶19

第一节　基因工程工具酶的概念19

第二节　限制性内切核酸酶20

一、寄主细胞控制的限制与修饰20

二、限制性核酸内切酶的种类21

三、影响限制性内切酶活性的因素24

四、限制性内切酶命名法24

五、限制性内切酶的作用特点与应用25

六、DNA的限制酶分析及物理图谱25

第三节 DNA聚合酶27

一、大肠杆菌DNA聚合酶　28

二、DNA聚合酶I大片段30

三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ31

四、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ31

五、T4-DNA聚合酶32

六、T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶33

七、耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）33

八、末端转移酶　35

九、反转录酶　35

十、真核生物的DNA聚合酶37

第四节 DNA连接酶37

一、DNA连接酶的一般性质37

二、DNA连接酶的作用机制38

三、真核生物的DNA连接酶40

第五节 S1核酸酶40

第六节 Ba/31核酸酶41

第七节 碱性磷酸酶41

第八节 T4多聚核苷酸激酶42

复习思考题42

第三章 基因载体的选择与构建43

第一节 基因载体、报告基因与载体的致死效应43

一、基因载体的概念43

二、载体的报告基因（标记基因）44

三、载体的致死效应44

第二节 细菌质粒载体45

一、质粒的概念45

二、质粒的复制和遗传46

三、质粒的种类46

四、质粒的相容性47

五、质粒的报告基因48

六、质粒的改造49

七、质粒载体的多克隆位点50

八、质粒DNA的提取50

九、常用的质粒载体52

十、质粒的用途与发展的质粒克隆载体56

第三节 噬菌体载体60

一、噬菌体和噬菌体载体60

二、λ噬菌体的生物学60

三、野生型λ噬菌体的改造64

四、λ噬菌体的包装与克隆65

五、单链噬菌体载体和噬菌粒68

六、黏性质粒载体70

第四节 酵母细胞克隆载体与酵母人工染色体72

一、酵母附加体型质粒（YEps）73

二、酵母整合型质粒（YIps）74

三、酵母复制型质粒（YRps）与酵母着丝粒质粒（Ycps）75

四、酵母人工染色体（YAC）75

五、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC）77

六、穿梭质粒79

第五节 动物病毒载体81

一、动物病毒载体的特点81

二、杆状病毒载体81

三、SV40载体84

四、痘苗病毒载体86

五、反转录病毒载体86

六、其他动物病毒载体88

第六节 植物病毒载体88

复习思考题89

第四章 目的基因的制取91

第一节 目的基因制取的策略91

一、外源基因与目的基因91

二、目的基因制取的策略91

第二节 鸟枪法制取目的基因92

一、“鸟枪法”的概念92

二、“鸟枪法”制取目的基因的特点93

三、“鸟枪法”的主要步骤94

四、枯草杆菌鸟枪法基因克隆94

第三节 物理化学法分离目的基因95

第四节 化学合成基因95

一、聚核苷酸化学合成的历史96

二、磷酸二酯法合成DNA97

三、固相亚磷酰胺法98

四、DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用100

第五节 反转录合成DNA102

复习思考题104

第五章 基因与载体的连接105

第一节 基因重组克隆与亚克隆105

第二节 基因重组对载体的要求与载体类型106

一、克隆载体106

二、表达载体106

第三节 连接前的处理107

第四节 黏性末端连接108

一、单酶切位点的黏端连接108

二、双酶切片段的定向克隆111

三、不同限制酶切位点的黏端连接112

第五节 平端连接114

第六节 人工接头连接116

第七节 同聚寡核苷酸末端连接118

复习思考题120

第六章 重组DNA导入受体细胞121

第一节 克隆与导入方法121

第二节 转化122

一、大肠杆菌宿主菌122

二、受体细菌的感受态123

三、转化反应123

四、枯草芽孢杆菌的转化反应124

第三节 转染125

一、磷酸钙沉淀法125

二、体外包装转染法126

第四节 共转化126

第五节 电转化127

第六节 基因枪法（微弹技术）129

第七节 微注射技术130

第八节 脂质体导入法131

第九节 转化酵母菌132

第十节 植物细胞的基因转移方法133

第十一节 哺乳动物细胞基因导入法133

第十二节 反转录病毒载体的转染135

复习思考题136

第七章 聚合酶链式反应137

第一节 PCR技术基本原理137

第二节 PCR反应体系与引物设计141

一、PCR反应体系141

二、设计PCR引物时的一般原则143

第三节 PCR一般循环参数144

第四节 影响PCR反应结果的因素145

第五节 PCR技术用于基因克隆146

一、目的基因的直接克隆146

二、目的基因的cDNA的克隆146

三、PCR技术用于基因克隆的其他方式147

第六节 发展中的各种PCR应用技术147

一、反转录PCR147

二、反向PCR149

三、复合PCR150

四、定量PCR153

五、不对称PCR153

六、嵌套PCR154

七、免疫PCR154

八、长PCR155

九、热启动PCR155

十、标记PCR（彩色PCR）155

十一、重组PCR156

十二、差向显示PCR156

十三、降落PCR156

十四、兼并引物PCR157

十五、原位PCR157

十六、玻片PCR158

十七、连接酶链反应（LCR）158

十八、MSP甲基化特异PCR160

第七节 各种PCR突变检测技术160

第八节 关于PCR技术应用的小结162

复习思考题162

第八章 基因文库的构建163

第一节 基因文库的概念与文库的类别163

一、基因文库的概念163

二、基因文库的类别163

三、基因文库的大小165

第二节 基因文库的构建167

一、基因组文库的构建167

二、cDNA文库的构建171

第三节 利用PCR技术构建cDNA文库176

第四节 全长cDNA文库的构建178

一、cDNA文库的质量与全长cDNA178

二、RACE构建cDNA文库179

三、用oligo-capping法构建全长cDNA文库181

四、SMART技术183

第五节 差示文库与消减文库186

一、mRNA差别显示186

二、差别杂交法与差示文库188

三、消减杂交法与消减文库190

四、代表性差异显示（RDA）192

五、抑制消减杂交194

第六节 染色体或区域特异性cDNA文库197

第七节 人工染色体文库198

一、酵母人工染色体（YAC）文库198

二、细菌人工染色体（BAC）文库200

复习思考题202

第九章 重组体的鉴定与文库筛选203

第一节 重组体转化子的鉴定与文库筛选203

第二节 遗传检测筛选法204

一、根据载体表型特征的直接选择法204

二、根据插入序列表型特征的直接选择法205

第三节 物理检测法205

一、凝胶电泳检测法205

二、限制酶切分析法208

三、异源双链杂交检测法与R-环检测法208

第四节 核酸杂交法209

一、以寡核苷酸探针筛选目的基因209

二、原位杂交与寡核苷酸探针筛选文库212

三、Southern印迹杂交213

四、Northern印迹杂交214

第五节 免疫化学检测法214

一、各种标记的免疫化学检测法215

二、以单克隆抗体探针筛选目的基因216

三、表达载体产物免疫化学检测法217

第六节 检测蛋白质筛选克隆基因217

第七节 体外表达筛选技术（表达检测系统）220

第八节 cDNA文库筛选的方法223

第九节 cDNA文库的标准化225

第十节 BAC文库鉴定和筛选229

复习思考题230

第十章 目的基因的表达231

第一节 原核生物基因表达调控的生物学231

一、原核细胞表达的特点231

二、原核生物的转录调控231

三、原核生物基因的转录后调控233

第二节 真核生物基因表达的调控234

一、DNA染色质结构的调控与顺反子的概念234

二、转录调控234

三、RNA对基因表达的调控235

四、翻译过程的调控235

第三节 基因工程中的基因表达235

一、制约目的基因表达的因素235

二、阅读框架236

三、启动子及其保守序列的影响236

四、终止子和衰减子的影响237

五、翻译过程对表达的影响238

第四节 融合基因与融合蛋白的表达239

第五节 以大肠杆菌为代表的原核表达体系240

一、大肠杆菌表达系统的特点240

二、大肠杆菌表达融合蛋白240

三、大肠杆菌细胞包涵体241

四、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径242

第六节 表达型载体243

第七节 真核表达体系的特点与外源基因在真核细胞表达248

第八节 酵母表达体系248

一、酿酒酵母中外源基因的表达249

二、甲醇酵母中外源基因的表达249

三、出芽酵母中外源基因的表达249

四、常用的酵母转化方法250

五、酵母表达外源基因的缺陷和改进方法250

第九节 昆虫或昆虫细胞表达体系251

第十节 哺乳动物细胞表达体系254

第十一节 新型的胞浆表达体系254

复习思考题255

第十一章 转座子在基因工程中的应用256

一、DNA的转座现象与转座子256

二、质粒的转座子259

三、转座作用的机制259

四、转座的遗传学效应260

五、控制转座与监测转座子261

六、转座子基因标签法261

七、标签的策略264

八、标签基因的分离和克隆265

九、转座子技术的发展与应用前景268

复习思考题269

第十二章 核苷酸序列测定270

一、Sanger酶法（双脱氧链终止法）270

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法273

三、定向测序法276

四、鸟枪法测序278

五、人工转座子法282

六、杂交测序技术282

七、PCR测序285

八、自动化测序法286

九、几种正在发展的测序方法287

十、DNA序列测定的策略与发展方向291

复习思考题292

第十三章 基因克隆的策略和技术293

第一节 基因克隆方法的种类293

第二节 经典文库克隆与特异抗体克隆技术294

第三节 定位克隆策略295

一、定位克隆的基本原理295

二、定位克隆的三个主要步骤297

三、定位克隆的主要操作过程299

四、定位克隆的主要策略303

五、大片段DNA克隆文库的载体305

六、功能互作研究与定位克隆的应用与发展305

第四节 表型克隆的策略308

一、基因组错配筛选（GMS）308

二、随机引物PCR310

三、外显子扩增技术（exon-PCR）311

四、表型克隆与定位克隆策略的比较311

第五节 cDNA克隆策略312

第六节 生物信息基因克隆技术313

复习思考题317

第十四章 基因打靶、反义技术与核酶技术318

第一节 基因打靶技术318

一、基因打靶的主要实验系统318

二、基因打靶的主要步骤319

三、筛选基因打靶命中的细胞株320

四、基因打靶技术的策略与技术321

五、大规模随机基因剔除——基因捕获324

六、基因敲人法研制转基因小鼠325

七、基因打靶技术的特点326

八、基因打靶技术的应用326

第二节 反义技术327

一、反义链与反义寡核苷酸327

二、反义技术的原理329

三、人工设计反义RNA的策略329

四、反义技术的特点331

五、ASON的改造与反义药物331

第三节 核酶技术331

一、核酶的特性与作用331

二、核酶的设计332

三、核酶的克隆和应用333

第四节 反义技术与核酶技术的应用333

复习思考题336

第十五章 蛋白质工程337

第一节 蛋白质工程与基因工程337

第二节 蛋白质结构分析、功能的设计与改造338

一、蛋白质结构分析338

二、蛋白质结构、功能的设计338

三、蛋白质结构改造338

第三节 蛋白质工程的一般流程341

第四节 功能克隆策略——噬菌体展示技术341

一、丝状噬菌体展示系统342

二、T4噬菌体展示系统343

三、λ噬菌体展示系统344

四、噬菌体展示基本操作过程347

五、抗体表面展示351

第五节 细菌表面展示生物技术352

一、革兰阴性菌表面展示353

二、革兰阳性菌表面展示353

第六节 酵母表面展示系统354

第七节 其他体外展示技术354

第八节 蛋白质工程的新策略——分子定向进化355

一、易错PCR355

二、DNA改组技术355

三、交错延伸技术357

四、体外随机引发重组358

五、杂合酶技术359

六、蛋白质分子定向进化技术的发展359

第九节 蛋白质工程的应用与发展前景360

复习思考题361

第十六章 基因工程下游工程的分化363

第一节 下游常用的分离、纯化、分析鉴定技术363

一、DNA合成粗产物的提纯363

二、蛋白质产品常用的分离提取技术364

第二节 原核细胞表达系统与发酵工程366

第三节 植物基因工程366

第四节 昆虫或动物细胞表达系统368

第五节 动物基因工程368

第六节 基因工程与产业化369

第七节 基因工程药物与疫苗371

第八节 基因治疗372

复习思考题373

索引374