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第1章 分光光度技术1

第一节 基本原理1

一、光的基本知识1

二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律2

第二节 分光光度计结构简介3

一、光源3

二、分光系统（单色器）4

三、狭缝4

四、比色杯4

五、检测器系统4

第三节 分光光度技术的应用5

一、测定溶液中物质的含量5

二、用紫外光谱鉴定化合物5

第四节 分光光度法的误差6

第五节 常见国产分光光度计的使用6

一、721型分光光度计6

二、751型分光光度计7

三、使用分光光度计的注意事项8

思考题9

参考文献9

第2章 液相色谱技术10

第一节 色谱原理及基本装置11

一、色谱的基本理论11

二、柱色谱的基本装置及基本操作13

第二节 凝胶色谱14

一、凝胶过滤的原理14

二、相关概念和基本参数15

三、凝胶的分类16

四、凝胶色谱的操作19

五、凝胶色谱的应用21

第三节 离子交换色谱22

一、基本原理22

二、离子交换剂的类型及性质23

三、离子交换剂的选择25

四、离子交换色谱的操作要点25

五、离子交换色谱的应用27

第四节 亲和色谱27

一、亲和色谱的基本原理27

二、亲和吸附剂28

三、亲和色谱的基本操作29

四、亲和色谱的应用30

第五节 高效液相色谱31

一、高效液相色谱基本原理及特点31

二、高效液相色谱流程及设备32

三、高效液相色谱技术的分类与应用33

四、快速蛋白液相色谱（FPLC）34

思考题35

参考文献35

第3章 电泳技术36

第一节 基本原理37

第二节 影响电泳的因素38

一、溶液的pH38

二、溶液的离子强度38

三、电场强度38

四、电渗现象39

五、支持介质的筛孔39

第三节 电泳的种类和应用39

一、醋酸纤维薄膜电泳39

二、琼脂糖凝胶电泳40

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳41

四、等电聚焦45

五、毛细管电泳45

六、双向电泳46

七、变性梯度凝胶电泳48

第四节 电泳后大分子的检测49

一、染色显示法49

二、微量光密度计测定法51

思考题51

参考文献51

第4章 离心技术52

第一节 离心作用的基本原理52

一、离心力52

二、相对离心力52

三、沉降速度53

四、沉降系数53

五、沉降时间54

六、K系数54

第二节 离心机的类型54

一、制备型离心机54

二、分析型离心机55

第三节 制备型超速离心的分离方法56

一、差速沉降离心法56

二、密度梯度区带离心法56

第四节 离心机使用原则及注意事项58

思考题59

参考文献59

第5章 荧光分析技术60

第一节 荧光的基本知识60

一、荧光的发光原理60

二、荧光色素的性质60

三、荧光的淬灭及抗淬灭62

四、常用的荧光染料（探针）62

第二节 免疫荧光细胞化学和荧光原位杂交技术64

一、免疫荧光细胞化学技术64

二、荧光原位杂交65

三、荧光显微镜66

第三节 流式细胞术67

一、流式细胞仪的基本结构和工作原理67

二、流式细胞术的应用68

第四节 实时荧光定量PCR技术69

一、荧光定量化学原理69

二、荧光定量PCR仪的光学原理70

三、荧光定量原理70

四、样品制备及操作71

五、主要用途72

思考题72

参考文献73

第6章 蛋白质分离与制备技术74

第一节 概述74

第二节 选择材料及预处理75

第三节 细胞的破碎及细胞器的分离75

一、细胞的破碎75

二、细胞器的分离76

第四节 蛋白质的提取、分离与纯化77

一、蛋白质（包括酶）的提取77

二、蛋白质的分离与纯化78

第五节 蛋白质定量及纯度分析84

一、蛋白质定量84

二、蛋白质纯度鉴定86

第六节 蛋白质相对分子质量测定87

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量87

二、凝胶过滤法测定蛋白质的相对分子质量87

三、沉降法（超速离心法）87

第七节 蛋白质的浓缩、干燥及贮存88

一、样品的浓缩88

二、干燥89

三、贮存89

思考题90

参考文献90

第7章 DNA重组技术91

第一节 核酸的提取92

一、DNA的提取92

二、RNA的提取92

三、核酸的纯化92

四、核酸的浓缩93

五、核酸定量及纯度分析93

第二节 目的基因的获取93

一、直接从染色体中分离93

二、化学合成法93

三、RT-PCR93

四、构建基因组文库及cDNA文库94

五、聚合酶链反应94

第三节 分子克隆载体与宿主细胞的选择94

一、质粒95

二、噬菌体95

三、噬菌粒96

四、黏粒97

五、DNA病毒载体SV4097

六、反转录病毒载体97

七、宿主细胞98

第四节 分子克隆常用的工具酶98

一、限制性核酸内切酶99

二、DNA聚合酶99

三、DNA连接酶100

四、末端脱氧核苷酸转移酶100

五、核酸酶100

六、脱氧核糖核酸酶100

七、碱性磷酸酶100

第五节 限制性内切酶对DNA的酶切及片段回收100

一、限制性内切酶的选择101

二、限制性内切酶的酶切101

三、琼脂糖凝胶电泳分离和DNA片段的回收102

四、琼脂糖凝胶中回收DNA片段的纯化103

第六节 外源基因与载体的连接103

第七节 重组DNA导入宿主细胞104

一、大肠杆菌的转化104

二、电脉冲穿孔法转化大肠杆菌105

第八节 含重组质粒的宿主菌落的筛选与鉴定105

一、利用宿主细胞遗传表型的改变进行筛选105

二、根据重组子分子结构特性进行鉴定106

思考题107

参考文献107

第8章 重组DNA的表达技术108

第一节 大肠杆菌表达系统108

一、大肠杆菌表达载体的构成108

二、常用的大肠杆菌表达载体110

三、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略115

四、表达产物的检测116

五、原核表达系统的优缺点116

第二节 真核细胞表达系统118

一、哺乳动物细胞表达载体118

二、哺乳动物细胞的基因导入123

三、表达产物的鉴定124

四、其他真核表达系统124

思考题124

参考文献125

第9章 核酸杂交技术126

第一节 核酸杂交的基本理论126

一、DNA变性126

二、DNA复性127

三、核酸分子杂交127

第二节 核酸探针及其标记128

一、核酸探针的种类及应用128

二、标记物的应用及选择129

第三节核酸探针的标记方法131

一、缺口平移法131

二、随机引物法131

三、用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端131

四、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段快速标记DNA探针末端132

五、非放射性物质标记核酸132

第四节 核酸分子杂交方法134

一、核酸分子杂交的类型134

二、核酸分子杂交实验因素的优化138

第五节DNA芯片技术141

思考题142

参考文献143

第10章 聚合酶链反应技术144

第一节 PCR技术基本原理、特点及影响因素144

一、PCR技术的基本原理144

二、PCR技术的基本特点144

三、影响PCR反应的因素146

第二节 PCR的基本步骤147

第三节 PCR反应条件的优化148

一、PCR反应条件的常规优化方法148

二、降落PCR149

第四节 PCR引物设计149

一、PCR引物设计的基本原则149

二、引物设计软件150

第五节 反转录PCR技术150

一、反转录PCR技术的基本原理150

二、反转录PCR的基本步骤150

三、反转录PCR的影响因素151

第六节 PCR技术的应用151

一、PCR技术在分子生物学领域的应用151

二、PCR技术在临床医学领域的应用153

思考题154

参考文献154

第11章 蛋白质结构与功能研究的手段155

第一节 蛋白质结构分析155

一、蛋白质一级结构——氨基酸组成与序列测定156

二、蛋白质的高级结构分析159

第二节 蛋白质功能研究160

一、蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法161

二、蛋白质—DNA相互作用的研究方法164

第三节 蛋白质功能研究的其他策略165

一、蛋白质芯片技术165

二、质谱在大规模蛋白质相互作用分析中的应用165

三、串联亲和纯化166

四、纳米技术167

五、RNA干扰167

六、miRNA169

思考题170

参考文献170

第12章 生物信息学分析的基本方法171

第一节 核酸和蛋白质数据库171

一、核酸序列数据库171

二、蛋白质序列数据库174

第二节 综合信息检索系统174

第三节 序列比对分析176

第四节 生物信息学数据库的数据挖掘178

思考题179

参考文献179

实验第一部分 生物化学实验180

实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应180

一、蛋白质的加热变性凝固180

二、蛋白质沉淀反应180

实验二 血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化及鉴定183

一、分离纯化183

二、醋酸纤维素薄膜电泳187

实验三 蛋白质的定量实验190

一、紫外吸收法190

二、劳里法（Lowry法）191

三、染料法192

实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量193

实验五 蛋白质印迹分析198

实验六 碱性磷酸酶的分离纯化及比活性的测定200

实验七 酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响204

一、酶的特异性204

二、温度对酶活性的影响205

三、pH对酶活性的影响205

实验八 碱性磷酸酶的Km值测定及磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用207

一、碱性磷酸酶的Km值测定207

二、磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用208

实验九 脲酶Km值简易测定210

实验十 乳酸脱氢酶同工酶分析212

实验十一 乳酸脱氢酶及辅酶的作用214

实验十二 激素对血糖的调节216

激素对血糖浓度的影响（葡萄糖氧化酶法）216

实验十三 血清转氨酶活性的测定217

实验十四 血清总胆固醇测定（硫磷铁法）220

实验十五 尿素氮测定及回收率221

实验第二部分 分子生物学实验224

实验十六 载体的选择和制备224

质粒DNA的制备与纯化224

实验十七DNA的纯度、浓度和构象分析226

实验十八 目的基因的获取229

一、DNA为模板的PCR扩增实验229

二、RT-PCR——mRNA反转录生成cDNA231

实验十九 DNA的限制性内切酶消化233

实验二十 DNA片段回收235

实验二十一 DNA片段的连接反应237

实验二十二 用重组质粒DNA转化大肠杆菌238

实验二十三 含重组质粒的细菌菌落的鉴定240

实验二十四 地高辛精标记核酸探针的斑点杂交及免疫检测242

实验二十五 生物信息学分析基本方法实验244

附录一 实验须知245

一、实验室规则245

二、实验室常识245

三、实验室安全246

四、实验室急救246

五、移液器的使用及注意事项247

六、玻璃仪器的清洗及各种洗涤液的配制248

附录二 生物化学常用试剂的配制及参数250

一、常用缓冲溶液的配制250

二、百分浓度酸、碱溶液的配制253

三、易变质及需要特殊方法保存的试剂253

四、常用酸碱相对密度和浓度的关系254

五、冷却剂和干燥剂254

六、色谱法常用资料256

七、常用放射性核素及测量单位259

八、离心机转数260

九、基本单位的词头260

十、常用药品中英文对照及其分子式和相对分子质量261

附录三 分子生物学实验中常用的数据资料267

一、常用的数据资料267

二、常用贮存液的配制270