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概述1

一、基因工程1

二、基因工程的发展历程3

三、基因工程研究现状及发展趋势3

上篇 动物基因工程的分子生物学基础7

第一章 动物基因的结构与组合7

第一节 动物基因的分子结构7

一、DNA的碱基组成8

二、DNA的一级结构8

三、DNA的二级结构9

四、染色体11

第二节 动物基因的重复序列12

一、动物基因的重复序列13

二、动物DNA重复序列的组织形式14

第三节 动物基因的组织形式16

一、动物基因的不连续性17

二、基因家族和基因簇22

三、串联重复基因22

四、侧翼序列22

第四节 基因及基因组的大小29

一、动物基因的大小29

二、动物基因组的大小30

第五节 线粒体基因组31

第二章 DNA复制34

第一节 DNA复制机制35

一、半保留复制35

二、θ方式和滚环方式37

第二节 DNA的复制过程39

一、复制的起始和方向39

二、DNA双螺旋的解开39

三、RNA引物的合成40

四、半不连续复制40

五、引发和引发体41

六、链的延伸44

七、链的终止44

八、复制的忠实性45

第三节 动物染色体DNA复制46

一、动物DNA复制起始点与起始46

二、延伸47

三、复制终止47

四、端粒的复制47

第三章 动物基因的转录及转录水平的调控49

第一节 转录的机制49

一、转录起始50

二、转录的延伸53

三、转录终止54

第二节 基因转录产物的后加工57

一、rRNA的转录后加工57

二、tRNA的转录后加工58

三、mRNA的转录与后加工58

第三节 真核基因转录水平的调控67

一、基因结构的活化68

二、转录起始的调控71

三、转录过程的调控75

第四章 蛋白质的生物合成及翻译水平的调控76

第一节 遗传密码76

第二节 tRNA及其功能78

第三节 核糖体的结构和装配80

第四节 真核生物蛋白质的合成81

一、原核生物蛋白质生物合成机制82

二、真核生物蛋白质的生物合成87

第五节 蛋白质翻译初始产物的修饰91

第六节 翻译水平的调控93

一、翻译因子磷酸化调控95

二、转铁蛋白mRNA翻译的调控模式96

下篇 动物基因工程操作97

第五章 基因工程中的常用技术97

第一节 凝胶电泳技术97

一、凝胶电泳的基本原理97

二、琼脂糖凝胶电泳98

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳104

第二节 核酸分子杂交技术107

一、放射性同位素标记的DNA探针的制备108

二、待测核酸的处理109

三、杂交及杂交后漂洗110

四、自显影110

第三节 细菌转化116

第四节 DNA核苷酸序列分析技术117

一、Sanger双脱氧链终止法117

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法118

第五节 PCR扩增技术119

一、基本原理119

二、PCR的设计和参数120

三、PCR技术的应用126

第六章 基因工程常用的酶类128

第一节 限制性核酸内切酶和DNA分子的体外切割128

一、Ⅱ类限制性内切酶的基本特点128

二、限制性内切酶的来源及命名133

三、影响限制性内切酶活性的因素133

四、限制性内切酶酶切图谱分析134

第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接135

一、DNA连接酶135

二、DNA的连接方法136

第三节 DNA聚合酶及其在基因工程中的应用136

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）137

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）138

三、T4噬菌体DNA聚合酶138

四、T7噬菌体DNA聚合酶139

五、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）139

六、Taq DNA聚合酶及Ampli TaqTM DNA聚合酶139

七、反转录酶（依赖于RNA的 DNA聚合酶）140

八、末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶）141

第四节 核酸外切酶及核酸内切酶141

一、核酸外切酶141

二、核酸内切酶142

第五节 其他DNA和RNA的修饰酶及其应用143

第七章 基因工程的载体和宿主表达系统144

第一节 细菌质粒载体144

一、质粒的基本特性145

二、不同用途的细菌质粒载体146

第二节 噬菌体载体152

一、λ噬菌体153

二、M13噬菌体154

第三节 酵母系统载体155

一、酵母整合质粒156

二、酵母复制子质粒156

三、酵母游离基因载体157

第四节 动物病毒载体157

一、病毒颗粒载体157

二、病毒DNA混合型载体159

第五节 原核细胞表达系统161

一、影响真核基因在大肠杆菌中表达的主要因素162

二、外源基因在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白164

三、重组蛋白分泌到周质166

四、重组蛋白分泌到胞外培养基中168

第六节 真核细胞表达系统169

一、酵母表达系统169

二、哺乳动物细胞表达系统173

第七节 个体表达系统176

第八章 基因工程的基本操作程序177

第一节 基因工程的基本程序177

第二节 DNA体外重组和扩增178

一、目的基因的制备和载体基因的选择与改造178

二、目的DNA片段与载体DNA体外重组184

三、重组子的扩增189

第三节 重组DNA分子的选择与鉴定190

一、抗性选择190

二、从转化菌落快速提取质粒鉴定大小选择重组质粒191

三、快速提取质粒进行酶切鉴定192

四、菌落杂交法挑选重组质粒194

五、DNA的序列分析195

第四节 重组DNA的表达与表达产物的检测195

一、磷酸钙和DNA共沉淀物的转染197

二、改进的磷酸钙介导细胞转染法199

三、DEAE-葡聚糖介导的转染200

四、利用聚阳离子介导的DNA转染202

五、利用原生质体融合进行DNA转染203

六、电穿孔法DNA转染204

七、重组DNA表达及表达产物的检测与分析205

第九章 转基因动物206

第一节 转基因的设计和制备206

一、转基因及转基因的设计206

二、转基因的制备211

三、影响基因转移的因素213

四、动物转基因的效率214

五、动物转基因的表达特性214

六、动物转基因的生物学效应215

第二节 显微注射法制备转基因动物216

一、转基因鼠的制备216

二、转基因羊的制备231

三、显微注射生产转基因牛233

第三节 转基因动物的检测237

一、DNA整合水平的检测239

二、RNA转录水平的检测245

三、蛋白质水平的表达检测247

第四节 转基因动物品系的建立252

一、纯合子转基因动物的鉴定253

二、转基因拷贝数的测定253

三、转基因表达产物或表型的定量254

四、分裂间期核的原位杂交254

五、试繁殖254

六、应用侧翼序列探针的Southern blot检测254

七、RT-PCR检测255

第五节 培育转基因动物的其他方法255

一、胚胎干细胞介导的转基因255

二、逆转录病毒介导的转基因255

三、精子载体介导的转基因256

第六节 动物乳腺生物反应器257

一、动物乳腺是外源蛋白质合成的首选器官257

二、乳腺定位表达载体的构建策略258

三、目的基因的选择259

第七节 转基因动物的应用及前景260

第十章 动物细胞工程264

第一节 动物细胞的培养265

一、培养细胞的起源和特征265

二、动物细胞培养的基本技术266

第二节 细胞融合与重组274

一、细胞融合的基本技术275

二、融合后杂种细胞的筛选276

三、融合细胞的特征及应用277

第三节 单克隆抗体制备技术281

一、制备单克隆抗体的基本原理与程序281

二、单克隆抗体的应用284

第四节 染色体转移284

一、微细胞介导的基因转移法285

二、染色体介导的基因转移法286

第五节 DNA介导的基因转移289

一、基因导入细胞的途径289

二、转化细胞的选择290

三、外源基因在哺乳动物细胞中的表达290

四、DNA介导的基因转移的应用291

第六节 核移植技术292

一、低等动物的核移植292

二、哺乳动物的核移植293

第七节 胚胎干细胞简介293

一、胚胎干细胞的基体特征293

二、胚胎干细胞的分离和培养294

三、胚胎干细胞的个体发育294

第十一章 动物基因治疗与基因免疫295

第一节 基因治疗及其基本程序295

一、基因治疗的基本概念295

二、基因治疗的分子机制296

三、基因治疗的基本程序296

第二节 基因治疗的载体构建297

一、目的基因297

二、基因治疗的载体构建298

第三节 基因治疗的基因转移方式302

一、直接注射法302

二、外源基因体外转移后返回体内303

三、呼吸道气溶胶法304

四、基因枪粒子轰击基因转移技术304

第四节 疾病的基因治疗304

一、遗传病的基因治疗305

二、肿瘤性疾病的基因治疗305

三、病毒病的基因治疗307

四、基因治疗的副反应及其对策307

第五节 基因免疫308

一、基因疫苗的概念308

二、基因疫苗的特点309

三、基因疫苗的免疫机制310

四、基因疫苗的抗原呈递310

五、基因疫苗的免疫途径312

第六节 基因疫苗载体的构建与表达检测313

一、基因疫苗抗原基因313

二、用于构建基因疫苗的载体315

三、重组质粒在体外真核细胞中的表达与检测315

四、基因疫苗制备316

第七节 基因疫苗免疫方法316

一、肌肉注射法317

二、皮内注射法319

三、静脉注射法320

四、黏膜免疫法320

五、基因枪法321

六、基因疫苗的免疫剂量和免疫次数321

七、基因疫苗免疫效果检测322

第八节 影响基因疫苗免疫效果的因素323

一、载体构件对基因疫苗免疫效果的影响323

二、接种方法对免疫效果的影响325

三、免疫佐剂和辅佐分子的作用325

四、个体差异对基因免疫效果的影响327

第九节 基因疫苗的安全性327

一、局部反应和全身毒性评定328

二、遗传毒性评定328

三、生殖毒性评定329

四、肿瘤发生评定329

英文缩写330

主要参考文献333